Efecto de sustancias protectoras sobre la viabilidad de lactobacilos durante el estrés por liofilización y almacenamiento

MARIA SILVINA JUAREZ TOMAS; ELENA BRU; GLADYS MARTOS; MARIA ELENA FÁTIMA NADER

Buenos Aires

Congreso; Baires Biotech. Congreso Internacional. Grupo Biotecnologia. VI Simposio Nacional de Biotecnología. Encuentro Trinacional Redbio Argentina.-Chile-Uruguay.; 2005

Red Bio Argentina. Grupo Biotecnologia

(5) Efecto de sustancias protectoras sobre la viabilidad de lactobacilos durante el estrés por liofilización y almacenamiento M. Silvina Juárez Tomás1, Elena Bru1, Gladys Martos1 y M. Elena Nader-Macías1 1CERELA (Centro de Referencia para Lactobacilos)-CONICET, Chacabuco 145, Tucumán, Argentina. E-mail: fnader@cerela.org.ar Introducción Los lactobacilos se han propuesto como microorganismos probióticos para restaurar el equilibrio ecológico del tracto urogenital (Lepargneur y Rousseau, 2002). Los microorganismos probióticos deben exhibir propiedades tecnológicas entre las que se encuentra la resistencia a las condiciones adversas del proceso de producción de biomasa y conservación (por ej liofilización o secado por spray). Para evitar o reducir la injuria de las células microbianas durante la liofilización (Castro et al., 1997), en este trabajo se evaluó el efecto de diferentes crioprotectores sobre la viabilidad de tres cepas de lactobacilos vaginales probióticos  al estrés por liofilización y conservación en el tiempo. Metodología Lactobacillus gasseri CRL 1259, L. johnsonii CRL 1294 y L. salivarius CRL 1328, seleccionados previamente por sus propiedades benéficas (Ocaña et al. 1999), se sub-cultivaron tres veces en LAPTg caldo a 37°C. El último cultivo, concentrado 10 veces, se resuspendió en diferentes mezclas protectoras: sacarosa 12%, lactosa 12%, leche 6%, sacarosa 12% en leche 6%, y lactosa 12% en leche 6%. Las suspensiones se liofilizaron en ampollas de vidrio, las que se almacenaron a 7°C. Se determinó viabilidad de microorganismos antes y después del proceso de liofilización, y en períodos de 6 meses, hasta los 2 años, por duplicado. Se aplicó el test de Scheffé para evaluar estadísticamente la pérdida de viabilidad durante el proceso de liofilización. Para comparar el efecto de los diferentes crioprotectores sobre la viabilidad de cada microorganismo durante el almacenamiento, se realizó el análisis de la varianza con medidas repetidas en el tiempo. Resultados y Discusión En cada uno de los microorganismos evaluados las sustancias más efectivas para proteger a las células microbianas durante la liofilización fueron aquellas en las que la pérdida de viabilidad no fue significativa (Tabla 1): L. gasseri CRL 1259 en lactosa o lactosa/leche (pérdida de viabilidad de aproximadamente 0,25 unidades log, con un promedio de 52% de recuperación); L. johnsonii CRL 1294 en lactosa/leche (0,54 y 0,11 unidades log, respectivamente, de diferencia entre recuentos pre y post-liofilización, correspondientes a 24 y 78% de recuperación); y L. salivarius CRL 1328 en los tres crioprotectores individuales, siendo mayor la recuperación en lactosa (62%, con una disminución de 0,19 unidades log). Tabla 1. Efecto de medios crioprotectores sobre la viabilidad de lactobacilos vaginales durante el proceso de liofilización. Cepa Medio protector A B (A-B) L. gasseri CRL 1259 Sacarosa 9,761 9,062 0,70 Lactosa 9,401 9,161 0,24 Leche 9,911 9,062 0,85 Sacarosa/Leche/ 9,911 9,332 0,58 Lactosa/ Leche 9,801 9,551 0,25 L. johnsonii CRL 1294 Sacarosa 8,701 6,532 2,17 Lactosa 8,481 6,182 2,30 Leche 8,691 7,442 1,25 Sacarosa/Leche/ 9,071 8,512 0,56 Lactosa/ Leche 8,931 8,821 0,11 L. salivarius CRL 1328 Sacarosa 10,691 9,941 0,75 Lactosa 10,251 10,061 0,19 Leche 10,271 9,421 0,85 Sacarosa/Leche/ 10,521 8,782 1,74 Lactosa/ Leche 10,401 9,332 1,07 A: Log UFC/ml pre-liofilización; B: Log UFC/ml post-liofilización; (A-B): Diferencia recuentos pre y post-liofilización. 1,2 Superíndices diferentes indican diferencias significativas (p < 0,05) entre los recuentos pre y post-liofilización en cada medio protector. La respuesta al estrés por almacenamiento de cultivos liofilizados depende de cada microorganismo y crioprotector empleado. En L. gasseri CRL 1259, leche fue el protector menos efectivo, con pérdida significativa de viabilidad (4 unidades log) en los tres primeros meses de almacenamiento (Fig. 1). En cambio, en las condiciones restantes se recuperaron entre 1 x 107 y 1 x 108 UFC/ml (máximo porcentaje de sobrevida en lactosa) a los 24 meses de conservación.   Figura 1. Sobrevida de L. gasseri CRL 1259 liofilizado durante 24 meses La mayor sobrevida de L. johnsonii CRL 1294 durante la conservación se observó en las condiciones que protegieron mas durante el proceso de liofilización (Tabla 1 y Fig. 2). En tales condiciones, los porcentajes de recuperación a los 24 meses fueron bajos: 7 x 105 UFC/ml (0,1% de sobrevida) en leche/lactosa, y 5 x 104 UFC/ml (0,02% de sobrevida) en leche/sacarosa.   Figura 2. Sobrevida de L. johnsonii CRL 1294 liofilizado durante 24 meses En L. salivarius CRL 1328, sacarosa individualmente mostró un efecto estadísticamente diferente a los protectores restantes, y perjudicial sobre este microorganismo conservado durante 24 meses (Fig. 3). La condición óptima de almacenamiento liofilizado fue lactosa/leche, sin pérdida significativa de viabilidad durante dos años de conservación (40% de sobrevida). Los efectos protectores de lactosa, leche y leche/sacarosa fueron estadísticamente semejantes entre sí, con valores finales de células viables entre 3 y 6 x 107 UFC/ml.   Figura 3. Sobrevida de L. salivarius CRL 1328 liofilizado durante 24 meses Conclusiones El grado de estrés producido por la liofilización y la conservación es diferente en cada uno de los probióticos vaginales ensayados. En L. gasseri CRL 1259 la liofilización en presencia de lactosa individualmente permitió obtener una mayor sobrevida en el tiempo. En cambio, en los microorganismos restantes, fue necesaria la mezcla de un hidrato de carbono en leche. L. salivarius CRL 1328 fue el microorganismo más resistente a la conservación por liofilización, sin presentar pérdida significativa de viabilidad durante 2 años en lactosa/leche. Referencias bibliográficas Castro HP, et al. (1997). Journal of Applied Microbiology 82: 87-94. Lepargneur JP, y Rousseau V.(2002). Journal of Gynecol Obstet Biol Reprod 31: 485-494. Ocaña VS, et al. 1999. Journal of General and Applied Microbiology 45: 203-12.