INVESTIGADORES
ABBA Martin Carlos
congresos y reuniones científicas
Título:
Desarrollo de un sistema de expresión condicional del gen RHBDD2 para su sobreexpresión en un ratón transgénico.
Autor/es:
LACUNZA E; ABBA MC; ALDAZ CM
Lugar:
La Plata
Reunión:
Jornada; Jornadas Medicina 2011; 2011
Institución organizadora:
Facultad de Ciencias Médicas - UNLP
Resumen:
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-->Introducción:
En estudios previos hemos identificado al gen RHBDD2
sobreexpresado en carcinomas invasores de mama. Hasta el momento se
desconoce el rol funcional de dicha alteración aunque existen
evidencias de que podría determinar un fenotipo favorable para las
células tumorales. A fin de
analizar in vivo las
consecuencias biológicas de la sobreexpresión del gen RHBDD2,
se llevó a cabo la construcción de un sistema de expresión
condicional, para su inyección en células madres embrionarias de
ratón. Este modelo permitirá inducir la sobreexpresión de RHBDD2
de manera temporal y tejido específica. Objetivos:
Desarrollar un sistema de sobreexpresión del gen RHBDD2 in
vivo. Materiales
y métodos: La secuencia codificante del
gen RHBDD2 se obtuvo mediante la técnica de PCR a partir del
plásmido poTB7 que contiene al ADNc total de RHBDD2. Para ello se
diseñaron cebadores, flanqueantes de la región ORF, en cuyos
extremos 5´ se adicionaron los sitios de restricción de las enzimas
SalI y BamHI. Se empleó la enzima T4 ligasa para clonar el inserto,
el cual contiene el ADNc de RHBDD2, en el vector de transporte
RFNLIII, previamente cortado con las enzimas SalI y BamHI. El
plásmido resultante fue verificado mediante secuenciación directa,
aislado y purificado por el método de Midiprep. Se lo incubó con
las enzimas KpnI y NheI para obtener un nuevo inserto con regiones
homólogas al Vector de Base Rosa26. El Vector de Base Rosa26, el
cual contiene un promotor CAGGS y un cassette lox-STOP-lox fue
transformado por electroporación en las células SW102 de E coli,
previamente tratadas para hacerlas electrocompetentes. Las células
con el Vector de Base en su interior fueron transformadas por
electroporación con el nuevo inserto proveniente del plásmido RFNL.
Se plaqueó luego con los antibióticos de selección ampicilina,
cloranfenicol, tetraciclina y kanamicina y se incubó a 32° 48hs. Se
verificaron las colonias recombinantes, se amplificaron y se aisló y
purificó al plásmido recombinado. Resultados:
Mediante la tecnología de clonación y recombinación génica se
clonó al cDNA del gen RHBDD2 en el plásmido de transporte RFNLIII,
el cual fue verificado por secuenciación directa. Se obtuvo luego el
inserto recombinante para clonar en el vector de Base Rosa 26.
Finalmente, se obtuvo al plásmido recombinado, que contiene al
sistema CreLoxP y al gen RHBDD2, constituyendo un constructo de
expresión condicional. Conclusiones:
Como etapa previa y fundamental en la obtención de un ratón
transgénico que exprese de manera condicional al gen RHBDD2, se
desarrolló un constructo que contiene al gen precedido por el
cassette lox-STOP-lox y el promotor CAGGS. Este sistema de
sobreexpresión condicional permitirá, en una siguiente etapa,
simular el rol biológico de RHBDD2 en la glándula mamaria del ratón
in vivo.