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UN ARABINANO SULFATADO CON ACTIVIDAD ANTICOAGULANTE POR INTERACCION DIRECTA CON TROMBINA Marina Ciancia1,2, Fernández P.V.1, Estevez J. M.3, Cerezo A.S.2, Pol-Fachin L.4, Verli H.4, Quintana I.5 1Cátedra de Química de Biomoléculas-Departamento de Biología Aplicada y Alimentos -Facultad de Agronomía-Universidad de Buenos Aires-Av. San Martín 4453-1417 Buenos Aires-Argentina, 2 CIHIDECAR, CONICET-Departamento de Química Orgánica-Facultad de Ciencias Exactas y Naturales-Universidad de Buenos Aires-Pabellón 2, Ciudad Universitaria-1428 Buenos Aires-Argentina. 3Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, Ciudad Universitaria - Pabellón 2, 1428 Buenos Aires, Argentina. 4Programa de Pos-Graduação em Biologia Celular e Molecular, Centro de Biotecnologia, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Brasil.5Laboratorio de Hemostasia y Trombosis, Departamento de Química Biológica, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, Ciudad Universitaria - Pabellón 2, C1428EHA Buenos Aires, Argentina. Correo electrónico: ciancia@agro.uba.ar Se aisló un arabinano altamente sulfatado (Ab1), con una relación molar sulfato:arabinosa 1,8:1,0, + 167,5 º y peso molecular promedio numérico de 180 KDa del alga verde Codium vermilara por precipitación con KCl 0,115 M. Por desulfatación de Ab1 se obtuvo un producto (DAb1) con 50,3 º. Se realizó el estudio estructural de ambos polisacáridos por análisis por metilación y espectroscopía de RMN. Se determinó que el producto sulfatado estaba compuesto principalmente por unidades de b-l-arabinopiranosa sulfatadas en C-2 y C-4 y enlazadas por C-3, aunque también se encontraron unidades monosulfatadas en C-4 y cantidades menores de unidades sulfatadas solo en C-2 o sin sulfatar. El análisis de DAb1 dio los resultados esperados teniendo en cuenta la estructura del polisacárido de partida. Se logró la asignación completa de las señales en los espectros de ambos arabinanos. Ab1 mostró una importante actividad anticoagulante, determinada por los ensayos globales de coagulación (para una solución de 5 mg/ml, el valor de APTT fue 2,6 veces el del control, mientras que el de TT, mayor que 10). Por medio de ensayos amidolíticos utilizando fibrinógeno purificado, se demostró que Ab1 ejercía un efecto directo sobre la trombina, aunque este efecto era mayor sobre trombina bovina que sobre trombina humana. Además, se comprobó que Ab1 ejercía un efecto anticoagulante adicional por potenciación de antitrombina y cofactor II de la heparina. La interacción entre la trombina y el arabinano persulfatado se simuló utilizando dinámica molecular. Se observó que la unión de Ab1 al exositio 2 de la trombina afecta la flexibilidad de diferentes porciones de la enzima, una de ellas muy próxima al sitio activo. Por otra parte, el grupo sulfato en C-2 pareciera interactuar más intensamente con la trombina. Por otro lado, el arabinano no parece promover cambios conformacionales importantes en el sitio catalítico cuando se compleja con el exositio 1. Por SDS-PAGE se determinó que Ab1 no forma un complejo estable con la trombina. Al igual que Ab1, los inhibidores directos univalentes de trombina (DTIs), forman complejos reversibles con la enzima y, además, inhiben tanto a la trombina libre como unida y no inducen trombocitopenia. Sin embargo los DTIs interactúan solo con el sitio activo. La l-arabinosa es un componente habitual de diferentes polímeros de pared celular. Si bien la forma piranósica es termodinámicamente más estable, en estos compuestos se halla principalmente en la forma furanósica. Esta es la primera vez que se aisló de fuentes naturales un polisacárido formado únicamente por unidades de arabinosa piranósica.

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