Edición génica multi target en papa para la reducción del endulzamiento inducido por frío y resistencia a golpes

MASSA, GABRIELA A.; GONZÁLEZ, MATÍAS N.; POULSEN HORNUM, ANABELA; DÉCIMA ONETO, CECILIA A.; ARIZMENDI, AILÍN; FEINGOLD, SERGIO E.

Simposio; ¨Biotecnología para un mundo en cambio¨ XIV Simposio REDBIO 2023; 2023

REDBIO Argentina

Una de las Nuevas Técnicas de Mejoramiento (NBT) con mayor potencial en elmejoramiento, es la de Edición Génica (EG), mediada por el sistema CRISPR/Cas9. Enpapa, la EG podría modificar sustancialmente el esquema de los programas demejoramiento, ya que permitirá mejorar variedades establecidas y adaptadas, evitandola perturbación del fondo genético. El almacenamiento de los tubérculos a bajastemperaturas es un proceso que afecta la calidad, ya que, a temperaturas menores a 10°C, la sacarosa es metabolizada por la enzima invertasa vacuolar (InvVac), a glucosa yfructosa (azúcares reductores; AR) que se acumulan en los tubérculos. Este fenómenose conoce como endulzamiento inducido por frío (CIS) y altera la calidad de las papasdestinadas a procesamiento y a consumo fresco. Durante el fritado ocurre la reacciónno enzimática de Maillard que genera pigmentos poliméricos de color marrón oscuro ycompuestos perjudiciales para la salud como la acrilamida. El pardeamiento enzimático es un proceso que ocurre como consecuencia de los daños mecánicos sufridos por lostubérculos durante la cosecha y post-cosecha. Este fenómeno reduce la calidadnutricional de productos frescos y procesados y es producido por la actividad de laspolifenol oxidasas (PPO), enzimas que catalizan la conversión dependiente de O2 demonofenoles y difenoles a quinonas y polímeros similares a la melanina. En papa, el genStPPO2 es el responsable de más del 60% de la actividad de PPO en tubérculos. El cultivar(cv.) Spunta es la variedad más usada para consumo fresco en nuestro país y presentaalta acumulación de AR y una alta actividad de PPO en tubérculo. El objetivo de estetrabajo es obtener papas del cv. Spunta resistentes a CIS y a golpes mediante el knockoutsimultáneo de los genes InvVac y StPPO2 mediante EG mediada por RNPs del sistemaCRISPR/Cas9. Las RNPs, formadas por un RNA guía (sgRNA) para cada gen y la proteínaCas9, se utilizaron para transfectar protoplastos del cv. Spunta. La detección de ediciónse realizó mediante secuenciación masiva por NGS de los productos de PCR para ambasregiones blanco. Del experimento E03 donde se combinaron los sgRNA 157 (StPPO2) yG0 (InvVac), se obtuvieron 29 líneas y de las 23 analizadas el 64% mostró edición paraInvVac y 100% para StPPO2 (en al menos un alelo). Para el experimento E04 con lacombinación de sgRNA 157 y G10 (InvVac), se obtuvieron 119 líneas, se analizaron 21 y28% mostró edición para InvVac y 100% para StPPO2 (en al menos un alelo).Notablemente, la línea 9 del E04 posee 3 alelos editados para cada gen y la línea 28 delE03, posee todos los alelos editados para el gen InvVac. Estas y otras líneas congenotipos deseados serán evaluadas fenotípicamente. Este trabajo presenta porprimera vez la utilización de RNPs aplicados a edición génica multi-target en papa ydemuestra la capacidad del sistema CRISPR/Cas9 para el potencial mejoramiento ensimultáneo de dos caracteres de calidad post-cosecha en este importante cultivo.