Expresión y purificación de la proteína de la cápside del Virus Y de la papa

MORA-ALVARADO, E; IBAÑEZ, LI; GUDESBLAT, G

Buenos Aires

Simposio; XIV Simposio REDBIO Argentina. Biotecnología para un mundo en cambio; 2023

REDBIO

La papa es un alimento tradicional en nuestro país, se consumen aproximadamente 60kg/cápita/año. Diferentes tipos de virus afectan a este cultivo siendo los principales elvirus Y de la papa (PVY), el virus X de la papa (PVX), y el virus del enrollamiento de lahoja de la papa (PLRV). PVY es un virus que posee un genoma de ARN de cadena simple,infecta principalmente a solanáceas y causa grandes pérdidas de rendimiento en loscultivos de papa, tabaco y pimienta. La detección de PVY en papas semilla es obligatoriasegún la normativa de SENASA y actualmente las pruebas de detección se realizanmediante kits de ELISA importados que se basan en la detección de la proteína de lacápside (CP) del virus usando anticuerpos policlonales o monoclonales. Losnanoanticuerpos (NAcs) son fragmentos de anticuerpos que se producen a partir deinmunoglobulinas de camélidos. Estos anticuerpos tienen alta sensibilidad y afinidad yse los puede producir a bajo costo y con altos rendimientos en sistemas bacterianos. Sepueden usar para reemplazar a los anticuerpos convencionales en los sistemas dedetección permitiendo abaratar el costo de los mismos sin ocasionar pérdidas en susensibilidad y especificidad. Este trabajo tiene como objetivo generar NAcs capaces dereconocer a la proteína CP de PVY con el fin de generar un sistema de diagnóstico delvirus, que se pueda producir a bajo costo y que permita reemplazar las importacionesde kit comerciales. Para la expresión de la proteína de la cápside se transformaronbacterias E. coli BL21 y WK6 con un plásmido que codifica para la proteína de la cápsidede la variante PVYO. Se optimizaron las condiciones de expresión modificandoparámetros como concentración de IPTG (Isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido),temperatura y tiempos de incubación. Una vez establecidas y aplicadas las mejorescondiciones para la expresión de CP, el cultivo bacteriano se centrifugó, el pellet seresuspendió en buffer fosfato conteniendo PMSF y se sonicó para extraer las proteínasdel citoplasma. Los restos celulares y proteínas insolubles fueron eliminados porcentrifugación y la purificación de las proteínas solubles se llevó a cabo mediantecromatografía de afinidad a iones metálicos inmovilizados usando una resina de níquel,ya que la proteína expresada contiene un tag de histidinas. Se logró expresar la proteínade la cápside de PVYO en E. coli con un rendimiento de 1.6 mg/L. Se logró obtenerproteína pura, libre de proteínas copurificadas, según se pudo determinar tiñendo ungel de acrilamida con coomassie blue brillant. Se generó suficiente masa de proteínapara realizar la inmunización de una llama, proceso que se encuentra en marcha. Seespera que una vez generada una biblioteca de NAcs a partir de los linfocitos de la llamainmunizada, se puedan seleccionar fragmentos de anticuerpos capaces de detectar laproteína CP con suficiente afinidad y especificidad para poder generar el sistema dediagnóstico propuesto.