MEDICIONES EN TIEMPO REAL DE LA ACTIVIDAD NFS1 HUMANA POR RMN

KARL. E. SEWELL; GABRIEL F. GOLA ; MARÍA FLORENCIA PIGNATARO; MARTÍN ARAN; JAVIER A. RAMIREZ; JAVIER SANTOS

Taller; V Taller Argentino de Resonancia Magnética; 2023

La cisteína desulfurasa mitocondrial NFS1 es una enzima clave involucrada en varios procesoscelulares. Entre ellos, participa en el ensamblaje de grupos de hierro y azufre, que es esencial para la respiración celular, la reparación del ADN y como fuente del cofactor para múltiples enzimas. Lasmutaciones de las proteínas que forman el supercomplejo NFS1 conducen a una variedad deenfermedades raras y graves, entre ellas la Ataxia de Friedreich.La cisteína desulfurasa NFS1 cataliza la eliminación del resto de azufre del sustrato L-Cys generando L-Ala y H2S. Para disponer de una nueva herramienta para estudios funcionales, decidimos evaluar la posibilidad de medir el producto L-Ala por RMN para seguir la reacción de forma directa y sencilla, con la ventaja de poder medir en tiempo real además de puntos finales, lo que abre la oportunidad de investigar algunos temas relevantes de esta vía metabólica multifacética y altamente canalizada.Esto es importante porque el método del azul de metileno que censa H2S y que se usa con másfrecuencia, como también otros que monitorean la concentración de L-Cys o L-Ala o H2S, funcionansolo para mediciones de punto final.En este trabajo, validamos la técnica para la medida in vitro del producto L-Ala por RMN-1H. A su vez, realizamos las mediciones en tres equipos diferentes (300, 500 y 600 MHz) calculando los límites de detección y cuantificación correspondientes. Observando que la sensibilidad y los tiempos de adquisición son aceptables y similares, lo que demuestra la gran versatilidad del método, pudiendo ser útil el equipo que se disponga. Los datos de puntos finales obtenidos por RMN se contrastaron con los medidos por azul de metileno, siendo todos del mismo orden. Presentando esta nueva metodología las ventajas de poder medir con menor error valores bajos de actividad, y no presentar un valor basal en las mediciones. Se continúo con las mediciones en tiempo real, obteniendo excelentes resultados. En la figura se muestra un ejemplo de la actividad de la variante NFS1 wildtype monitoreada por NMR-1H (300 MHz) durante más de 130 minutos observando la región correspondiente al doblete del metilo (δ 1,47) de L-Ala. Contando con esta nueva metodología, hemos comenzado el estudio de diversas variantes de NFS1que nos permitirán comprender mejor las relaciones entre estructura (rol de cada subunidad),dinámica y función del supercomplejo.