Validación de dos sondas fluorescentes para evaluar la actividad mitocondrial en ovocitos porcinos

FIAMMA SENGIALI; AGUSTINA CAMPORINO; PABLO CETICA; SERGIO MORADO

Jornada; XII Jornadas de Jóvenes Investigadores; 2023

La sonda catiónica JC-1 es utilizada para evidenciar variaciones en el potencial de membrana mitocondrial interna mediante cambios en su fluorescencia del verde al rojo debido a su agregación ante aumentos del potencial electroquímico. El MitoTracker Green (MTG) es una sonda fluorescente que difunde a través de la membrana plasmática y se acumula en mitocondrias activas. Nuestro objetivo fue validar ambas sondas para determinar la actividad mitocondrial en ovocitos porcinos. Se seleccionaron complejos ovocito-cumulus (COCs) obtenidos por punción-aspiración de folículos ováricos antrales de hembras faenadas y se incubaron 24h en medio 199 + eCG + EGF + fluido folicular porcino a 39°C, 5% CO2 y 100% humedad para comparar ovocitos inmaduros menos activos (estadio de vesícula germinal) con ovocitos más activos metabólicamente (estadio de metafase I). A las 0 y 24h se extrajeron cohortes de COCs, se denudaron con pipeta Pasteur fina y se dividieron en 4 grupos durante su incubación con cada sonda (45min para MTG y 30min para JC-1): control, cultivo en frío (5ºC), carbonil cianuro clorofenilhidrazona (CCCP, desacoplante de la fosforilación oxidativa) y cianuro de potasio (KCN, inhibidor del transporte electrónico). Mediante microscopía de epifluorescencia las mitocondrias activas se evaluaron con MTG utilizando un filtro de emisión de 520nM y el potencial de membrana mitocondrial con JC-1 utilizando filtros de emisión de 570nM (rojo) y 520nM (verde), considerando el cociente rojo/verde como valor por ovocito. Se obtuvieron microfotografías digitales que luego se procesaron mediante el software IMAGE J para calcular la luminosidad de cada ovocito. A las 0h se observaron disminuciones significativas en el potencial de membrana mitocondrial en los grupos incubados con CCCP, KCN y frío respecto al control (p