Avances y perspectivas del mejoramiento de papa por Edición Génica en INTA

MASSA, GABRIELA ALEJANDRA

Simposio; 2do Simposio de Mejoramiento Genético Vegetal; 2023

El almacenamiento de los tubérculos a bajas temperaturas (inferiores a 10 ºC) es necesario para disminuir la pérdida de agua, el envejecimiento, el brotado y la actividad de patógenos (Burton, 1969). Mientras que el almacenamiento en frío es útil para mantener la calidad de los tubérculos para consumo fresco, no es satisfactorio para las papas destinadas al procesamiento, debido a que la mayoría de los cultivares acumulan azúcares reductores (AR) a temperaturas inferiores a 10°C. La acumulación de AR es un problema en el procesamiento industrial de la papa, ya que durante las altas temperaturas de fritado los grupos carbonilo libres de los azúcares reductores y los grupos amino libres de los aminoácidos inician la reacción no enzimática de Maillard, que origina la formación de pigmentos poliméricos de color pardo oscuro denominados melanoidinas y de compuestos intermedios, algunos nocivos para la salud, como acrilamida. Como consecuencia de la reacción de Maillard las papas fritas adquieren un color marrón oscuro, sabor amargo e inferior valor nutritivo. Por lo tanto, la industria procesadora exige que el contenido de azúcares reductores en los tubérculos destinados a la producción de chips no debe exceder el 0,2-0,3% del peso en fresco. El endulzamiento inducido por frío ha sido correlacionado con el incremento de la actividad de las invertasas y de las enzimas que degradan almidón. El gen StInvVac (PGSC0003DMG400013856) codifica para la invertasa vacuolar. Esta enzima es la responsable del desdoblamiento de la sacarosa en fructosa y glucosa (azúcares reductores) y su expresión en tubérculos se ve aumentada a bajas temperatura. Dados los efectos indeseados de la actividad invertasa vacuolar en tubérculos almacenados a bajas temperatura, se buscó la pérdida de función para el gen StInvVac mediante edición génica mediada por CRISPR/Cas9. Se diseñaron 3 ARN guías (sgRNA) en regiones exónicas conservadas entre alelos. Se generaron dos vectores con diferentes combinaciones de sgRNA (crG0G4 y crG1G4) los que se utilizaron para transfectar protoplastos de los cultivares Spunta y Atlantic. Se obtuvieron 76 líneas de Spunta y 70 líneas de Atlantic para crGOG4 y 114 líneas de Spunta para crG1G4. A partir de análisis moleculares mediante secuenciación masiva por NGS se obtuvo que el porcentaje de edición de las líneas analizadas, fue de 5,3% en Sp-crG0G4, 17% en Atl-crG0G4. Para Sp-crG1G4 no se encontraron líneas editadas. Una única línea de Atlantic mostró ser full knock-out para InvVac (6A; 2,4%). En dicho análisis se confirmó que la línea 6A posee dos tipos de mutaciones en la región blanco del gARN0: i) una deleción de 2pb con una frecuencia del 76% y ii) una inserción de 1 pb con una frecuencia del 24% (Figura 3A y 3B). La frecuencia de los fragmentos analizados sugiere que habría tres alelos con deleción de 2bp y un alelo con inserción de 1bp. En ambos casos, el marco de lectura de traducción se ve afectado, lo que anticiparía una pérdida de función de la proteína resultante.Para determinar la resistencia al endulzamiento inducido por frío se plantaron en invernáculo 15 plántulas de papa de las líneas 37S, 75S, 6A, 13A y 38A y 15 plántulas de los cv. Spunta y Atlantic como control. El ciclo se desarrolló entre los meses de octubre a diciembre. A los 110 días se cosecharon los tubérculos. No hubo diferencias significativas en el rendimiento de cada línea editada respecto al control. El tamaño y forma de los tubérculos de las líneas editadas de Spunta presentaron un tamaño más chico y la forma era irregular (Fig. 2A). Las líneas editadas de Atlantic presentaron una forma y tamaño de tubérculos similares a los tubérculos de la línea control (Fig. 2B).Del total de tubérculos se dividieron en 3 grupos: i. almacenamiento a temperatura ambiente, ii. almacenamiento a 4ºC durante 15 días y iii. almacenamiento a 4ºC durante 60 días. Luego de pasado los días de almacenamiento correspondientes se realizó el fritado de las papas chips. Luego del fritado se realizó la toma del dato de color de dos maneras: 1- Se utilizó una carta de colores de 9 puntos desarrollada por el Instituto de Almacenamiento y Procesamiento de Productos Agrícolas de Wageningen, Holanda. La misma consiste en fotografías de chips de papa que van desde amarillo muy claro (9) a marrón muy oscuro (1): en este caso 4 personas diferentes observaron el color de las papas chips y le asignaron un puntaje según los colores de la carta de colores. Se realizó un promedio y se obtuvieron los valores presentados en la Tabla 2 y Figura 3. 2-Color utilizando colorímetro Minolta: se tomó una muestra de las papas chips, se trituraron y se colocaron en una placa de Petri. Luego se realizaron 3 mediciones en cada línea. Los valores a, b y L fueron utilizados para calcular el parámetro DW que es un indicador del blanqueamiento de la muestra (Tabla 2; Figura 4). Las líneas 6A y 38A fueron las líneas con los mejores valores en todas las determinaciones fenotípicas. A partir de las muestras de rodajas de chips crudas se realizó la cuantificación de azúcares reductores y sacarosa mediante HPLC (servicio brindado por el laboratorio Fares Taie, Mar del Plata). La línea 6A presentó valores muy inferiores de AR respecto al límite que posee la industria el cual es de 3 mg AR/gr peso fresco (Figura 5).Nuestros resultados demuestran que cultivares de interés comercial de papa pueden ser mejorados mediante la aplicación del sistema CRISPR/Cas9, generando productos de calidad superior que proporcionarán beneficios tanto para el circuito productivo e industrial, como para los/as consumidores/ras.Otro fenómeno que afecta la calidad de los tubérculos es el pardeamiento enzimático, el cual es un proceso que ocurre como consecuencia de los daños mecánicos sufridos por los tubérculos durante la cosecha y post-cosecha. Este fenómeno es producido por la actividad de las polifenol oxidasas (PPO), enzimas que catalizan la conversión dependiente de O2 de monofenoles y difenoles a quinonas y polímeros similares a la melanina. En papa, el gen StPPO2 es el responsable de más del 60% de la actividad de PPO en tubérculos. Otro de los objetivos del grupo es obtener papas del cv. Spunta resistentes a CIS y a golpes mediante el knock-out simultáneo de los genes StInvVac y StPPO2 mediante edición génica mediada por RNPs del sistema CRISPR/Cas9. Las RNPs, formadas por un RNA guía (sgRNA) para cada gen y la proteína Cas9, se utilizaron para transfectar protoplastos del cv. Spunta. Entre las líneas obtenidas, la línea 9 posee 3 alelos editados para cada gen y la línea 28 sólo posee todos los alelos editados para el gen StInvVac. Estas y otras líneas con genotipos deseados serán evaluadas fenotípicamente. Este trabajo presenta por primera vez la utilización de RNPs aplicados a edición génica multi-target en papa y demuestra la capacidad del sistema CRISPR/Cas9 para el potencial mejoramiento en simultáneo de dos caracteres de calidad post-cosecha en este importante cultivo.