Subclonado de las mutantes puntuales Tyr16Gly-TcHRG Y Tyr127Gly-TcHRG de Trypanosoma cruzi. Estudio del transporte de grupo hemo.

LARIVERA B*; SABTONE AB*; CRICCO JA; MEDIAVILLA MG

Rosario

Jornada; XVII Jornadas de Ciencia, Tecnologías e Innovación de la UNR; 2023

Universidad Nacional de Rosario

Nuestro grupo estudia el transporte y utilización de hemo en Trypanosoma cruzi, agente etiológico de la enfermedad de Chagas, que es incapaz de sintetizar este grupo prostético de novo. Estamos caracterizando una proteína intrínseca de membrana, ubicada en su bolsillo flagelar, TcHRG, que responde a los niveles extra/intracelulares de hemo para permitir su incorporación. Renberg et al. (DOI: 10.1371/journal.pntd.0003804) demostraron que las tirosinas Y18 e Y129 (ubicadas en segmentos transmembrana) de LRH1, su homóloga en Leishmania spp., son importantes para el transporte de hemo y para la replicación de la forma amastigote intracelular. Estas tirosinas están altamente conservadas y corresponden a las tirosinas Y16 e Y127 de TcHRG. Entonces, generamos las mutantes puntuales Y16G e Y127G de TcHRG ya que estos residuos podrían estar involucrados en su función/plegamiento/localización, con el propósito de realizar estudios funcionales que permitan determinar su importancia y/o esencialidad.El objetivo de este trabajo es sub-clonar las variantes TcHRG Y16G y TcHRG Y127G en vectores adecuados para su expresión en levaduras (Saccharomyces cerevisiae) y en T. cruzi con el fin de realizar, en un futuro, estudios funcionales en estos organismos: 1- de complementación en levaduras auxótrofas para hemo y 2- de dominancia negativa y capacidad de crecimiento/infección en el parásito.Metodología empleada y resultados preliminares: Los genes de las versiones mutantes fueron escindidos del plásmido pENTR3C (donde fueron originalmente clonados y secuenciados para comprobar la generación del cambio de aminoácido y la conservación del resto de la secuencia) mediante cortes con enzimas de restricción adecuadas y purificados para las subsiguientes reacciones de ligación en los plásmidos pRS426.M25 (para expresión en levaduras) y pTcIndex (para expresión en T. cruzi), ambos digeridos con enzimas de restricción compatibles. Las reacciones de ligación se utilizaron para transformar bacterias de Escherichia coli DH5α, seleccionando el crecimiento de las transformantes con ampicilina (resistencia codificada por estos vectores). En estos momentos estamos realizando los chequeos de colonias candidatas mediante técnica de PCR de colonias y por purificación de plásmidos y cortes con enzimas de restricción adecuadas.*Larivera, B. y Santone, A. contribuyeron igualmente a este trabajo.