Metodología diagnóstica de paratuberculosis en semen bovino

FERNÁNDEZ B.; JOLLY A.; COLAVECCHIA S.; CISALE H; FERNANDO PAOLICCHI; MUNDO SL.

CABA

Jornada; IX Jornadas de Jóvenes Investigadores; 2019

CyT, Facultad de Ciencias Veterinarias, UBA

La Paratuberculosis es una enfermedad granulomatosa crónica que afecta a los rumiantes y es causada por Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (Map). Los planes de control de la paratuberculosis plantean medidas de manejo para prevenir la transmisión por vía fecal-oral y trans-mamaria. Sin embargo, la venta de semen representa una potencial vía de trasmisión a rodeos no infectados. El objetivo del trabajo fue definir una metodología de obtención de ADN y de PCR para la identificación de Map en semen de bovinos. 600µl de semen bovino proveniente de pajuelas conservadas en nitrógeno líquido fueron contaminados con 108 UFC de Map Malele 35 (Patrón A e INMV 1 caracterizada por RFLPIS900 y MIRU-VNTR, respectivamente) y otra fracción de 600µl fue utilizada como control negativo. Se realizó una centrifugación a 12.000 rpm durante 30 minutos a 4°C y se extrajo el ADN mediante el tratamiento con trizol/cloroformo (Sigma) siguiendo las instrucciones del fabricante. La concentración del ADN obtenido se evaluó por NanoDrop. Para identificar Map por PCR, se utilizaron los cebadores (For: 5? GATCGGAACGTCGGCTGGTCAGG 3? y Rev: 5? GATCGCCTTGCTCATCGCTGCCG 3?) descriptos por Collins y col. (1993), que amplifican una secuencia de ADN del inserto IS900 de 217 pb. Las condiciones utilizadas fueron de 30 ciclos a 97°C durante 30 segundos (desnaturalización), seguidos de 65°C durante 1 minuto (apareamiento y extensión). Los amplicones fueron visualizados luego de la electroforesis en 1,5% agarosa en TBE y los geles fueron teñidos con GelStain (TransGen Biotech). Para descartar la presencia de inhibidores en la muestra, se amplificó el gen GAPDH.A partir del volumen inicial, se obtuvieron 416,5 y 1140 ng totales de ADN para el semen control y contaminado, respectivamente. El IS900-PCR permitió identificar el semen contaminado. Este trabajo está incluido en un proyecto que tiene como finalidad aportar nuevos datos sobre la paratuberculosis y mejorar la identificación temprana de animales reproductores de alto valor genético. Por lo tanto, la metodología desarrollada permite evaluar la presencia de Map en muestras de semen diluido y confirmar la ausencia de factores inhibidores. En este momento se está trabajando en la determinación de la sensibilidad analítica de esta metodología. Luego, se utilizará en muestras de campo de toros infectados con Map, a fin de mejorar las herramientas diagnósticas disponibles.