SILENCIAMIENTO GÉNICO EN LA ARQUEA HALÓFILA HALOFERAX VOLCANII UTILIZANDO TECNOLOGÍA CRISPRI

CERLETTI, MICAELA; GIMÉNEZ M., INÉS; COSTA, MARIANA; BAUER, JULIUS; DE LUCA, IARA; FERNÁNDEZ, GONZALO; FRECHA, SOFIA; GONZÁLEZ BLOTTA, LUCÍA; LANDABURU, MARINA; LORENZANI, SALVADOR; PRADO, MAIRA; SCHIEL, PAULA; ; FERRARI, M CELESTE; DE CASTRO, ROSANA; PAGGI, ROBERTO

Mar del Plata

Encuentro; BIOLOG@S EN RED; 2022

Las prácticas de laboratorio (PL) como estrategia didáctica implican un proceso deenseñanza-aprendizaje dinámico. Esto permite a los estudiantes realizar acciones psicomotorasy sociales a través del trabajo colaborativo (desarrollo de la parte experimental), asociar diversasfuentes de información para generar nuevas concepciones y afianzar conceptos teóricos(elaboración de un informe). Basados en esto, en la asignatura Biología y Bioquímica de losMicrorganismos generamos esta PL para conceptualizar el silenciamiento génico a través de lainactivación de un gen mediante ARN de interferencia (ARNi).En los últimos años se ha adaptado el sistema CRISPR-Cas, que representa el sistemainmune adaptativo de bacterias y arqueas, con el propósito de silenciar genes específicos(CRISPR de interferencia, CRISPRi). El sistema CRISPR-Cas en Haloferax volcanii fue modificadopara la represión de genes en plásmidos o cromosoma. Estudios realizados por nuestro grupode Investigación mostraron que la biosíntesis de pigmentos carotenoides en H. volcanii, entreotros procesos, está regulada por la proteasa de membrana LonB.Se plantearon los siguientes objetivos para la PL a) generar una cepa mutante conexpresión reducida del gen lonB en H. volcanii mediante CRISPRi; b) comprobar el silenciamientodel gen lonB mediante Western blot (WB); c) determinar el efecto del silenciamiento sobre lasíntesis de pigmentos y velocidad de crecimiento.Los estudiantes se dividieron en grupos y llevaron a cabo los protocolos que lespermitieron transformar H. volcanii con tres ARNi, analizar el fenotipo de las transformantes,realizar un WB con anticuerpos anti-Lon, monitorear el crecimiento, extraer y calcular laconcentración de pigmentos en las cepas control y silenciadas como métodos para determinarel silenciamiento de lonB y su efecto en la fisiología. Como resultados se obtuvieron cepas conexpresión reducida del gen de la proteasa lonB en H. volcanii con dos de las construccionescomprobando el silenciamiento mediante WB. Por otro lado, se determinó que el silenciamientoprodujo un aumento en la concentración de pigmentos y una disminución en la velocidad decrecimiento.