Estudio del rol del receptor de membrana de hormonas tiroideas, la integrina Alfa v beta3, en la respuesta a quimioterapia en cáncer de mama.

DÍAZ ALBUJA, J.A.; STERLE, HELENA; CAYROL, FLORENCIA; PAULAZO, ALEJANDRA; CAMPOS HAEDO, M.N.; DEBERNARDI, MERCEDES; SPEISKY, D; ERNST, G; URIBURU, J; MEDINA, VANINA ARACELI; ROSEMBLIT, CINTHIA; CREMASCHI, GRACIELA ALICIA; DÍAZ FLAQUÉ, M. CELESTE

Jornada; Jornadas Multidisciplinarias de Oncología del Instituto de Oncología ?Ángel H. Roffo?.; 2022

El cáncer de mama es el de mayor incidencia tanto a nivel mundial como en Argentina. Según estadísticas del Instituto Nacional del Cáncer, es la primera causa de muerte por tumores en mujeres, evidenciando en 2019 una tasa ajustada de 16,93 defunciones por cada 100.000 mujeres (1).A pesar del desarrollo de terapias novedosas, diseñadas específicamente para tratar diferentes subtipos de cáncer de mama, la mayoría de los tumores de cáncer de mama se tratan tarde o temprano con quimioterapia convencional. Los subtipos moleculares están definidos por la presencia de los receptores de estrógeno (ER), progesterona (PR) y HER-2 y los niveles de la proteína nuclear Ki-67, asociados a la proliferación celular (2), sin embargo, debido a la heterogeneidad tumoral es necesario definir nuevos marcadores que permitan identificar grupos con diferentes características moleculares para mejorar la decisión correcta del tratamiento.Gran parte de los datos recientes vinculan el estado tiroideo con la progresión del cáncer de mama (3-6). En este sentido, otros autores han visto alteraciones de la función tiroidea durante el tratamiento del cáncer de mama con quimioterapia y demostraron que la T3 induce la quimiosensibilización de las células cancerosas de mama (7). Un trabajo reciente de nuestro laboratorio demuestra que las hormonas tiroideas (HT) no solo inducen la proliferación de células de cáncer de mama, sino que también regulan la diseminación metastásica (8). Las hormonas tiroideas ejercen sus acciones biológicas mediante la unión a receptores nucleares o a un receptor de membrana, la integrina αvβ3 (9, 10). Se demostró que las hormonas tiroideas estimulan la proliferación (11) y la migración celular (12) de las células de cáncer de mama a través de la integrina αvβ3.Hemos demostrado previamente que las HT promueven la proliferación y diseminación de células de linfoma de células T a través de la integrina αvβ3 (13) y que podrían afectar los resultados de la quimioterapia convencional (14). Las integrinas son receptores de adhesión ampliamente expresados que median en las interacciones célula-célula y célula-matriz extracelular (MEC). Varios trabajos han analizado el papel de las integrinas en la patogenia, progresión tumoral, metástasis y como factor pronóstico en varios tipos de cáncer como el de ovario, mama y próstata (15-19). En este sentido, se demostró que la integrina β3 participa en la comunicación intracelular al promover la endocitosis de vesículas extracelulares que serían críticas para la metástasis del cáncer de mama (18). Además, se demostró que la interacción de la integrina αvβ3 con EDIL3, una proteína de matriz extracelular identificada como reguladora de la transición epitelial-mesenquimatosa (EMT), contribuye a la resistencia al paclitaxel en células de cáncer de mama y próstata (20). Sin embargo, el papel de la activación de la integrina αvβ3 por HT, así como los mecanismos moleculares involucrados en la resistencia a los medicamentos en el cáncer de mama, aún no han sido estudiados. En el presente trabajo evaluamos el impacto de la integrina αvβ3 como receptor de membrana de HT en el cáncer de mama. Además evaluamos mediante herramientas bioiformaticas la expresión del gen que codifica la subunidad β3 del receptor de membrana de las HT (ITGB3), como potencial biomarcador pronóstico en la respuesta del cáncer de mama a la quimioterapia. Estos hallazgos fueron confirmados por ensayos in vitro que mostraron la regulación de la viabilidad de las células de cáncer de mama y de la expresión de proteínas de resistencia a múltiples fármacos (MRP) inducida por HT a través de la integrina αvβ3.ResultadosExpresión del ARNm del receptor de membrana de la hormona tiroidea en pacientes con cáncer de mama. Primero, evaluamos la correlación entre la expresión de las subunidades alfa y beta de integrinas en tejido tumoral mamario en la base de datos TCGA-BCRA PanCancer Atlas, utilizando la herramienta en línea cBioPortal. Encontramos que la subunidad ITGAV se correlaciona significativa y positivamente con ITGB3 (Pearson=0,64), ITGB1 (Pearson=0,61), ITGB6 (Pearson=0,33) e ITGB5 (Pearson=0,36), pero no se encontró correlación con ITGB8 (Pearson=0,20) (Figura 1A). Otros autores describieron la heterodimerizacion de las subuniddes alfa y beta que conforman al dimero αvβ3 con otras integrinas y demostraron que la subunidad ITGAV puede heterodimerizar con las subunidades beta, ITGB3, ITGB1, ITGB6, ITGB8 e ITGB5, mientras que la subunidad ITGB3 heterodimeriza solo con ITGAV e ITGA2B (21). Como no hay correlación entre ITGB3 e ITGA2B (Pearson=0,21) y como este dímero solo se encuentra en las plaquetas (22) , consideramos que la subunidad β3 solo formaría heterodímeros con la subunidad αv, por lo tanto, continuamos los análisis con ITGB3.Valor pronóstico de ITGB3 en pacientes con cáncer de mama. Para determinar la importancia pronóstica de ITGB3 en pacientes con cáncer de mama, analizamos la supervivencia global (SG) en la base de datos antes mencionada (Figura 1B). Las curvas de Kaplan-Meier muestran una correlación negativa entre los niveles de ARNm de ITGB3 y la supervivencia de pacientes con cáncer de mama en el conjunto de datos TCGA- PanCancer Atlas. Estos resultados también se corroboraron en la base de datos de cáncer de mama GSE25066 (23) (Datos no mostrados). A partir de estos resultados analizamos si los niveles de ARNm de ITGB3 se correlacionaba con parámetros clinicopatológicos comúnmente asociados a la supervivencia global de pacientes con cáncer de mama. Los estudios bioinformáticos mostraron que no había correlación entre grado histológico, presencia de metastasis, edad de diagnostico y el nivel de ITGB3 (Figura 1C). Por lo tanto nos preguntamos si los resultados encontrados en los análisis de sobrevida podrían estar relacionados con la respuesta al tratamiento. Por esto, analizamos los niveles de expresión de ITGB3 en pacientes con cáncer de mama tratadas con quimioterapia utilizando la herramienta bioinformatica ROCplot (24). Los valores de área bajo la curva (AUC, del inglés area under curve) muestran los valores pronósticos del gen (AUC 0,5-0,7 para biomarcadores con potencial clínico; 0,7-0,8 para biomarcador de cáncer de alta calidad; +0,8 biomarcador blockbuster o estrella). Como se muestra en la figura 1B, los pacientes con cáncer de mama tratados con taxanos que no respondieron al tratamiento, expresan niveles más altos de ARNm de ITGB3 que aquellos que si respondieron (AUC=0,675, p=1,9e-07). Resultados similares se encontraron cuando se analizó la respuesta a antraciclinas (AUC=0,673, p=1,8e-10). Dado que el tratamiento de primera línea para los pacientes con TNBC es la quimioterapia convencional basada en antraciclinas y taxanos, confirmamos este resultado bioinformático analizando la expresión de ITGB3 por qRT-PCR en muestras tumorales embebidas en parafina de pacientes eutiroideos argentinos con TNBC, teniendo acceso a sus datos clinicopatológicos y de supervivencia. De acuerdo con el análisis bioinformático, ITGB3 se expresó significativamente más en los pacientes que no respondieron en comparación con los que respondieron (Figura 1C) (p = 0,0419).Expresión de proteínas de respuesta a múltiples fármacos en pacientes con cáncer de mama con baja o alta expresión de ITGB3. Regulación de su actividad por HT en células de cáncer de mama. La respuesta al tratamiento se debe comúnmente al desarrollo de resistencia a múltiples fármacos. En trabajos previos de nuestro laboratorio mostramos que las HT, en concentraciones fisiológicas y a través de la integrina v3, son capaces de modular los niveles de proteína y la actividad enzimática de moléculas involucradas en la respuesta a la quimioterapia en células T de linfoma (14). En este contexto, evaluamos mediante herramientas bioinformáticas la coexpresión de las subunidades que conforman al receptor de membrana de HT, integrina v3, con genes involucrados en la resistencia a fármacos en la base de datos TCGA. Encontramos correlaciones positivas entre ITGAV, ITGB3 y los niveles de ARNm de ABCB1 (P-gp /MDR1), ABCC1 (MRP1) y ABCG2 (BCRP1) (Figura 2A).Además, en las células de cáncer de mama humano, MDA-MB-231, las HT aumentan la expresión de los transportadores P-gp y BCRP (Figura 2B), y este efecto es revertido por el inhibidor farmacológico de la integrina v3, cilengitide. Por tanto, se evaluó el análisis funcional in vitro de las moléculas transportadoras en células MDA-MB-231 tratadas o no con HT, mediante la determinación de eflujo de Rho123. Como se muestra en la figura 2C, al evaluar la cinética del eflujo de Rho123 encontramos una fluorescencia significativamente menor en las células tratadas con HT a la hora del tratamiento. Después de este tiempo, se alcanza una meseta similar tanto en las células tratadas con HT como en las no tratadas. Como se esperaba, el cilengitide revierte el flujo de salida de Rho123 inducido por HT (Figura 2D), lo que indica que la integrina v3 está involucrada en estos mecanismos. Para explorar la inhibición de la integrina v3, en la respuesta a fármacos mediada por HT, realizamos un ensayo de viabilidad en presencia de cilengitide y el taxano, Paclitaxel. Tal como se esperaba el tratamiento con Paclitaxel disminuyó la viabilidad de las células MDA-MB-231 en las dosis ensayadas y este efecto fue contrarrestado cuando se utilizó esta droga en presencia de concentraciones fisiológicas de HT, vimos también que el bloqueo de la integrina αvβ3 con cilengitide previene este efecto (Figura 2E).ConclusionesAunque los tratamientos actuales pueden reducir el tamaño del tumor y aumentar la esperanza de vida, la recaída y la resistencia a múltiples fármacos siguen siendo la segunda causa principal de muerte por cáncer en los países desarrollados. En este estudio, encontramos que la integrina αvβ3, el receptor de membrana para las acciones no clásicas de HT, es un actor importante en la respuesta a la quimioterapia en pacientes con cáncer de mama. La quimiorresistencia es un desafío importante en el manejo del cáncer de mama. Desde la incorporación de nuevos biomarcadores en la estadificación del AJCC de la octava edición, el diagnóstico del cáncer de mama ha mejorado y la importancia pronóstica y predictiva de los factores biológicos es cada vez más relevante. Sin embargo, hasta la fecha, la prescripción de quimioterapia sistémica se basa principalmente en el riesgo clínico. Por lo tanto, es necesario encontrar nuevos biomarcadores que indiquen la mejor selección de la terapia con mejor resultado, o incluso la posibilidad de incluir otros fármacos que potencien el efecto de la terapia convencional.