Clonado y expresión de una proteína de fusión VP6 de rotavirus-Flagelina de Salmonella en E. coli

SILVESTRE D.; ARGÜELLES M.H; MANDILE M.G.; PERI IBAÑEZ E.S.; MORENO G.; GLIKMANN G.; RUMBO M.; CASTELLO A.A.; TEMPRANA C.F.

Quilmes

Simposio; 3ra Reunión de Jóvenes Investigadores de Ciencia y Tecnología - Simposio de Biología y Bioquímica; 2018

Universidad Nacional de Quilmes

Los rotavirus constituyen a nivel mundial uno de los principales agentes etiológicos de gastroenteritis severa en niños menores de cinco años. Desde el 2006, la implementación de dos vacunas de virus atenuado ha logrado reducir los índices de mortalidad. Sin embargo, aún continúa la búsqueda de alternativas de vacunas más eficaces y seguras, particularmente aquellas libres de virus con capacidad replicativa. Específicamente, nuestro interés es la evaluación de imunógenos capaces de inducir una respuesta inmune luego de su administración por vía de mucosas. La proteína VP6 de rotavirus es la más abundante del virión y se encuentra altamente conservada. Además, se ha demostrado que la inmunización con la misma en presencia de un adyuvante puede inducir una respuesta inmune protectora en el modelo murino de infección. Por otro lado, la flagelina ha sido propuesta como adyuvante de mucosas debido a su capacidad para activar receptores específicos del sistema inmune. De este modo, el objetivo del presente proyecto fue generar proteínas de fusión entre VP6 y una variante delecionada de flagelina (FliC) de Salmonella enterica serovar Typhimurium, fusionando sus secuencias codificantes mediante SOE-PCR. Los ORF fusionados fueron clonados en pET-22b y transformados en E. coli BL21. Posteriormente, se evaluó mediante SDS-PAGE la expresión de FliC-VP6-Histag, bajo distintas condiciones de inducción. Los resultados muestran que la mayor expresión de FliC-VP6-Histag se logra al inducir el cultivo a una densidad óptica a 600 nm de 0,5 utilizando una concentración final de IPTG de 0,5 mM e incubando a 30 °C por cinco horas post-inducción. Por otra parte, la identidad de la proteína fue confirmada mediante Western blot utilizando anticuerpos policlonales contra rotavirus. Se planea purificar la proteína de fusión haciendo uso del tag de histidinas, para posteriormente analizar su potencial inmunogénico frente a una inmunización por vía de mucosas en un modelo murino.