Enzimas inmovilizadas del veneno de cascabel para la producción de lisolecitinas

MARIA DEL ROSARIO ALONSO; LAURA LEIVA; SILVINA ECHEVERRIA; LUCIANO FUSCO

Buenos Aires

Congreso; XXIII ANNUAL MEETING OF THE ARGENTINEAN BIOLOGY SOCIETY (XXIII JORNADAS ANUALES DE LA SOCIEDAD ARGENTINA DE BIOLOGÍA); 2022

Sociedades de Biociencia

Las enzimas son catalizadores producidos por los seres vivos, altamente efectivas y se requieren en muy bajas concentraciones. Estas características las vuelve adecuadas para su uso en aplicaciones industriales, alimenticia, cosmética y farmacéutica, entre otras. En el NEA habitan especies que resultan de interés por ofrecer una secreción rica en enzimas que pueden tener aplicabilidad industrial, tal es el caso particular de la serpiente de cascabel (Crotalus durissus terrificus), la cual se caracteriza por presentar en su veneno un alto contenido de fosfolipasas A2 (PLA2). Estas enzimas actúan sobre los glicerofosfolípidos, liberan el ácido graso de la posición 2 del glicerol y conducen así a la formación de lisofosfolípidos. Estas moléculas, son excelentes emulsionantes y surfactantes adecuados para su uso en muchas aplicaciones industriales. A partir de estos antecedentes y teniendo en cuenta que los catalizadores deben permanecer en el medio de reacción cuando los productos de la catálisis son retirados, en el presente trabajo se llevó a cabo la inmovilización del veneno de la serpiente cascabel (rico en PLA2) con el fin de evaluar su actividad catalítica sobre una fuente rica en lecitinas para la obtención de lisolecitinas. El veneno fue inmovilizado en CNBr-activated Sepharose TM 4B a temperatura ambiente, bajo agitación magnética suave durante 24hs. La cantidad de veneno retenido se evaluó por medida de Absorbancia (UV-280nm) y la actividad de la enzima PLA2 presente en el veneno se determinó mediante ensayo colorimétrico con rojo fenol. Los extractos de lecitinas (ELs) se obtuvieron a partir de yema de huevo (20 g) mediante extracciones con disolvente: primera etapa con etanol (96%), y luego la fracción soluble se trató con acetona; finalmente, el precipitado se secó en estufa a 37ºC. Las lisolecitinas se obtuvieron mediante una reacción enzimática bajo sistema tipo batch con el ELs y la PLA2 previamente inmovilizada en buffer fosfato 10mM, durante 2 h bajo agitación suave a 37ºC. Tanto la muestra inicial (ELs) como la fase líquida luego del contacto del ELs con la enzima inmovilizada se sometieron a TLC sobre gel de sílice 60 F254 utilizando éter de petróleo/éter etílico/ ácido acético (90:10:1 v/v/v) y cloroformo/ metanol/ agua (65:35:3 v/v/v) como fases móviles. Se reveló con reactivo de Dragendorff.Las manchas obtenidas se analizaron por densitometría (software ImageJ), y se calculó el contenido porcentual relativo de lecitinas y lisolecitinas presentes en las diferentes muestras. La matriz CNBr-activated Sepharose TM 4B mostró una elevada capacidad de unión a proteína ofídicas ya que logró inmovilizar un 99,64% del contenido proteico presente en la solución inicial del veneno. Por otro lado, si bien las lisolecitinas están presentes en la muestra inicial de lecitinas, el tratamiento con la PLA2 inmovilizada elevó un 20% de lisofosfolípidos con respecto a la muestra inicial. Estos hallazgos preliminares permitirán contribuir al uso de matrices con enzimas inmovilizadas para la producción de lisolecitinas con potencial uso biotecnológico