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La sensibilidad y versatilidad de las técnicas de fluorescencia, en particular su uso en microscopía, ha permitido un importante avance en el estudio de la estructura y función celular. El desarrollo de sondas fluorescentes específicas, junto con métodos para introducir dichas sondas en células vivas y métodos de detección de células individuales brinda una oportunidad única en su capacidad para estudiar células vivientes debido a su sensibilidad y especificidad. La búsqueda de superación en el contraste de las imágenes obtenidas está limitada debido a un número de fenómenos no específicos que interfieren, como la autofluorescencia celular, la dispersión elástica (Rayleigh) e inelástica (Raman) y las contribuciones instrumentales espúreas como reflejos, luminiscencia de los componentes ópticos y ruido de los detectores. Simultáneamente se busca aumentar la sensibilidad de detección de señales intrínsecamente débiles (en el rango de la autoflorescencia celular) en células individuales y el control de las características espectroscópicas de dichas sondas. Se describirá el desarrollo de nuevos fluoróforos diseñados para superar las limitaciones actuales en el área. Se describirán en primer lugar compuestos destinados a permitir la determinación cuantitativa de transferencia de energía en microscopías ópticas. La irradiación con luz induce un cambio estructural del aceptor que da lugar a cambios en sus propiedades espectrales. El aceptor es elegido de modo tal que el espectro de absorción de sólo uno de los isómeros se superponga con el de emisión del donante. De esta forma el proceso de FRET puede ser "activado" o "desactivado" en forma reversible, posibilitando su determinación directa. Esta característica hace que el método sea especialmente adecuado para microscopía ya que genera el estado de referencia requerido para determinaciones cuantitativas de FRET, sin el requerimiento de la destrucción fotoquímica del aceptor, y así puede ser usado para mediciones continuas en estudios en células en cultivo. La evaluación del método pcFRET incluye la síntesis de un grupo de diariltenos con características espectrales adecuadas y su unión a un donante fluorescente utilizando separadores de distancia conocida. Asimismo se describirán sondas derivadas para uso celular. Por otra parte se describirá el desarrollo de nuevos compuestos fluorogénicos de tipo FlAsH y ReAsH cuya emisión puede ser modulada por pcFRET. Estos compuestos permiten el reconocimiento selectivo de motivos de tetracisteína Cys-Cys-X-X-Cys-Cys que pueden ser introducidos por expresión de proteínas modificadas genéticamente. Asimismo son permeables a través de membrana y constituyen una herramienta muy promisoria para el estudio de diversos mecanismos en células vivas.

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