PROYECTO: RELACIÓN ENTRE LAS ESPECIES REACTIVAS DEL OXÍGENO Y LOS SISTEMAS DE SEÑALIZACIÓN INTRACELULAR DURANTE LA MADURACIÓN Y ACTIVACIÓN IN VITRO DE OVOCITOS PORCINOS

AGUSTINA CAMPORINO; PABLO CETICA; SERGIO MORADO

Jornada; XI Jornadas de Jóvenes Investigadores; 2022

La producción in vitro de embriones porcinos ha ganado importancia no sólo para los programas de reproducción animal, sino también para estudios de transferencia genética y programas de xenotransplantes. A pesar de esto, múltiples factores limitan el éxito de la misma, entre ellos la adquisición incompleta de la maduración por el ovocito. Durante el proceso de maduración se producen una serie de modificaciones que pueden influir en la funcionalidad de la gameta. Un ejemplo de ellas es la variación en la producción de especies reactivas del oxígeno (ROS). El papel de dichas ROS en los procesos relacionados con la manipulación y el cultivo de gametas y embriones in vitro es contradictorio. En trabajos anteriores hemos demostrado que ciertos niveles de ROS serían necesarios para alcanzar una adecuada capacidad de maduración tanto en ovocitos bovinos como porcinos. Por lo tanto, el objetivo general de este proyecto es determinar la fluctuación en la producción de ROS durante la maduración de ovocitos porcinos in vitro y su posible relación con las vías de señalización involucradas en los eventos asociados a la maduración nuclear y citoplasmática del ovocito. Se obtendrán complejos ovocito-cumulus (COCs) inmaduros mediante la aspiración con aguja fina de folículos ováricos antrales de 3-8 mm de diámetro, provenientes de ovarios de hembras porcinas faenadas. Dichos COCs serán seleccionados bajo lupa estereoscópica y madurados in vitro durante 44 hs a 39°C, 5% CO2 en aire y 100% de humedad. En primera instancia se caracterizarán las fluctuaciones en los niveles de ROS, las mitocondrias activas y la producción de ATP a las 0, 12, 24, 36 y 44 hs del proceso de maduración in vitro de los ovocitos porcinos. Los niveles de ROS serán evaluados mediante la tinción con 2´,7´- diclorodihidro fluoresceína diacetato (DCH2FDA), el patrón de mitocondrias activas será evaluado mediante la tinción de Mitotracker Green y la producción de ATP será evaluada a través de un ensayo de bioluminiscencia basado en la reacción de la luciferina-luciferasa. Luego se analizará el efecto de la adición de carbonil cianuro m-clorofenil hidrazona (CCCP), un desacoplante del sistema de transporte de electrones de la cadena respiratoria mitocondrial, a una concentración tal que disminuya la producción de ROS pero no afecte los niveles de ATP del ovocito durante el proceso de maduración. Finalmente, se analizará la relación entre los niveles de ROS y el sistema de señalización intracelular de las RAS/MAP quinasas con el objetivo de analizar su vinculación con los procesos de maduración nuclear y citoplasmática de los ovocitos porcinos. Dicho ensayo se realizará determinando el grado de activación de Erk ½ (MAPK) a través de técnicas de inmunotinción en presencia y en ausencia de CCCP. Los resultados generados a partir de este proyecto permitirán ampliar el conocimiento sobre los mecanismos involucrados en el proceso de maduración de los ovocitos, generando nuevas alternativas que aumenten la eficiencia de la producción de embriones in vitro en especies de interés zootécnico.