Deleción génica de la histona H2A.X de Toxoplasma gondii mediante CRISPR-Cas9.

CRISTALDI, CONSTANZA; CONSTANZA CRISTALDI, ROMÁN EMILIO MUSTAFÁ,VALENTINA MARTÍNEZ DAMONTE, MARIO PERELLÓ, SILVIA SUSANA RODRÍGUEZ, JESICA RAINGO; TOMÁS BLANZACO; AGUSTINA GANUZA; ANGEL, SERGIO O.; VANAGAS, LAURA

Congreso; XXXIII Reunión Anual SAP 2022; 2022

Toxoplasma gondii es un parasito intracelular obligado que pertenece al phylum Aplicomplexa, causante de la toxoplasmosis en humanos y animales de importancia ganadera, entre otros. Los tratamientos disponibles provocan muchos efectos adversos en los pacientes infectados, por lo que hay una intensa búsqueda de nuevas drogas que afecten de manera específica al parásito y no así a la célula hospedadora. Una vía muy conservada en T.gondii, es la vía de reparación del daño de ADN por rotura de doble cadena (DSB por sus siglas en inglés). Sin embargo, hay componentes importantes que están ausentes, sugiriendo que podría existir una divergencia con la vía de reparación de DSB de mamíferos, posiblemente involucrando componentes específicos del parásito. Una proteína muy importante de esta vía de reparación es la histona H2A.X, que se fosforila en un residuo de serina (S132) marcando foci de DSB. Al fosforilarse, permite el reclutamiento de diferentes proteínas requeridas para la reparación del daño. Con el objetivo de caracterizar el rol de esta histona en T.gondii, y su importancia en el mecanismo de reparación mencionado generamos líneas de T.gondii knockout (KO) empleando la técnica CRISPR-Cas9 en parásitos RHΔHXGPRT. Se diseñaron los guías, se incorporaron al plásmido, que además permite la expresión de la Cas9, y por otra parte se construyó un amplicón que contiene un cassette de selección de DHFR rodeado por 40 pb del 5´UTR y 3´UTR del gen de la histona. Los taquizoítos RHΔHXGPRT se co-transfectaron con el plásmido y amplicón. La incorporación del amplicón por doble recombinación homóloga, generando el KO de H2A.X, fue analizado por PCR en clones de taquizoítos seleccionados con la droga pirimetamina. Actualmente están en proceso de evaluación fenotípica. En conclusión, se generó una línea estable de taquizoítos de tipo I, RH, KO para la histona H2A.X que serán de utilidad para dilucidar el rol de la misma en el proceso de reparación del daño al ADN en T.gondii.