Determinación de contenido de glucosamina en biomasa fúngica

SILICARO M. A.; MARRAS C. M.; BEZAZIAN, A; MARÍA DEL PILAR NÚÑEZ; MARTINEZ M. E.; RIOS M. B.; ITRIA R. F.

CABA

Congreso; Tecno INTI 2022; 2022

INTI

DETERMINACIÓN DE CONTENIDO DE GLUCOSAMINA ENBIOMASA FÚNGICAINTRODUCCIÓNUn importante componente de las paredescelulares de la mayoría de los hongos es laquitina, un polímero lineal constituido porunidades de N-acetil-D-glucosamina unidas porenlaces β-D (1,4), como se observa en la figura1.Este polisacárido está también presente en losexoesqueletos de insectos y otros artrópodos[2] y resulta de suma importancia ya que puedeser utilizada como insumo para la producciónindustrial de quitosano.La determinación de glucosamina por hidrólisisde quitina constituye una herramientanecesaria para la estimación directa de la masadel polímero, como también una indirecta debiomasa fúngica tanto en el ambiente como enprocedimientos de laboratorio o industrial [3, 4].Poca de la bibliografía encontrada utiliza laquitina como parámetro para medir la biomasade hongos de pudrición blanca. Dentro de lostrabajos hallados, los protocolos que se llevana cabo para la determinación de quitina sonengorrosos [5].Es necesaria la búsqueda de protocolos mássencillos que permitan la detección de laquitina. Este trabajo plantea una modificación alprotocolo que presenta Plassard [5] en la cualse utilizó la técnica analítica de espectroscopíaUV-vis.OBJETIVOSRealizar comparaciones del contenido dequitina en las diferentes especies de hongos.Llevar a cabo un método sencillo y reproduciblepara determinar el contenido de glucosaminapresente en las distintas especies.DESARROLLOObtención de biomasa fúngica: se partió decultivos en medio líquido (extracto de maltaglucosada y medio Czapek) tanto encondiciones estáticas como en agitación. Elmicelio fue separado del medio de cultivo porfiltración con vacío y lavando con etanol, paradeshidratar y disgregar el micelio. Se completóel secado en estufa a 80 °C, hasta pesoconstante.Con el micelio seco de diferentes especiesfúngicas se realizaron los siguientes pasos:Hidrólisis: las muestras secas se sometieron auna digestión, en tubos de borosilicato contapas y contratapa de teflón, con 5 mL HCl 6Na 100 °C en termobloque (HACH modelo DRB200) durante 4 horas. A continuación, setomaron alícuotas de 1,5 mL en tubos tipoEppendorf y se centrifugaron por 10 minutos a14.000 rpm. Luego, 0,5 mL del sobrenadantese colocaron en tubo de hemólisis para elsiguiente paso.Alcalinización: al tubo del paso anterior se leadicionaron 1,5 mL de NaOH 3N junto a 1,5 mLde Na2HPO4 0,2N, verificando que el pH finalsea aproximadamente 8, vortexeando cadamuestra.Reacción: de la solución obtenida en el pasoanterior se la trasvasaron alícuotas de 0,5 mL atubos de borosilicato descriptos anteriormentejunto a 0,5 mL del reactivo A (1 mL deacetilacetona y 50 mL Na2CO3 0,25M). Secalentaron las muestras durante 20 minutos a100 °C. Luego de enfriarlos, se agregaron 3 mLde etanol 96°, vortexeando. Luego seagregaron 0,5 mL del reactivo B (2,67 g de pdimetilaminobenzaldehido en 100 mL de unasolución 1:1 de HCl y etanol 96°). Acontinuación, se calentaron las muestrasdurante 10 minutos a 70 °C. Una vez enfriadosa temperatura ambiente, se midió laabsorbancia a λ= 530 nm (Shimadzu modeloUV mini-1240). Con las absorbancias obtenidasse interpolaron los datos de la curva decalibración correspondiente del patrón deglucosamina (R2= 0,9851).Este mismo protocolo se puede aplicar ahongos cultivados en medios sólidos, como porejemplo aserrín o viruta, usando 3 mL de ácidoclorhídrico 6N, en lugar de 5 mL en el paso 1.RESULTADOSLas diferencias en el contenido de glucosamina(derivada de la quitina de la pared fúngica) esmás evidente entre distintas cepas que entrediferentes grupos taxonómicos (ej:basidiomicetes y ascomicetes), como seobserva en la figura 2:No se ven diferencias entre Ascomycetes(géneros Cladosporium, Aspergillus,Verticillium, Paecilomyces) y Basidiomycetes(Phaenerochaete, Pholiota, Pycnoporus,Ganoderma, Lentinus). Se puede observar quelos hongos con mayor concentración deglucosamina/mg de biomasa son los del géneroAspergillus (Ascomycota) y Phaenerochaetechrysosporium (Basidiomycota). Por otra parte,para las distintas cepas del géneroCladosporium se observan concentracionessimilares de glucosamina.DISCUSIÓN Y CONCLUSIONESSe logró determinar de manera satisfactoria elcontenido de glucosamina de las especiesanalizadas, de una forma eficiente y rápida. Lametodología optimizada tiene potencial paradiversas aplicaciones. En lo particular, con estemétodo se pretende estimar el contenido debiomasa fúngica en diversos soportes ysustratos sólidos para tres aplicacionestecnológicas desarrolladas en nuestro grupo:por un lado, la caracterización de micofiltrospara la adsorción de metales pesados ymetaloides, como el As presente en aguascontaminadas. Por otro, la caracterización desoportes colonizados con hongos paraprocesos de micorremediación de efluentes ypor otra parte, el desarrollo y caracterización debiomateriales fúngicos.El protocolo se pudo aplicar a una grancantidad de muestras, pudiendo analizarlas enpoco tiempo.