Microscopía de Expansión en Trypanosoma cruzi y su aplicación en el estudio de estructuras del citoesqueleto

COMPAGNUCCI G; MARTINEZ PERALTA G; ALONSO VL

Mendoza

Congreso; XI Congreso de la Sociedad Argentina de Protozoologia; 2022

Sociedad Argentina de Protozoologia

La microscopía de expansión (ExM), es un método para mejorar la resolución de la microscopía óptica mediante la expansión física de una muestra, ha sido descripta para distintos tipos celulares, pero no ha sido reportada aún en Trypanosoma cruzi. Durante la ExM, una red de polímero hinchable (o hidrogel) se sintetiza uniformemente a lo largo de una muestra biológica. Luego, las muestras se someten a un proceso de ablandamiento y homogeneización mecánica, seguido de un proceso de expansión física tridimensional isotrópica cuando se agrega agua, lo que hace que el polímero y, por lo tanto, la muestra en la que el polímero está incrustado se agrande. Como resultado, las biomoléculas de interés se separan espacialmente entre sí y aumenta la resolución efectiva del microscopio.Se realizó una búsqueda bibliográfica de los distintos protocolos disponibles en células de mamíferos y en los protozoos Toxoplasma gondii, Plasmodium ssp, y Trypanosoma brucei. Luego se optimizaron las condiciones para lograr visualizar la expansión de epimastigotes de T. cruzi. Se utilizaron como marcadores: DAPI (marca nuclear), TcHMGB (proteína nuclear), α-tubulina, α-tubulina acetilada, α-tubulina tirosinada y β-tubulina. Estos últimos marcan distintas estructuras del citoesqueleto de T. cruzi.Observamos que la morfología típica de los epimastigotes se conserva durante el proceso logrando un factor de expansión de 4.5 veces. Analizamos la expansión del núcleo, kinetoplasto y cuerpo basal para confirmar la expansión de los epimastigotes midiendo su tamaño con el software ImageJ.Estos resultados con permiten corroborar la utilidad de esta técnica para T. cruzi en especial para el análisis del citoesqueleto. También, se logró apreciar dentro del núcleo zonas con distinta intensidad de fluorescencia, lo que permite diferenciar zonas con distinta compactación de la cromatina sin tener que recurrir a microscopía de alta resolución.