Polímeros de polietilenimina como plataforma para desarrollar nanosistemas de transfección y sensores electroquímicos

AGUSTIN J. BYRNE; PABLO BOSCH; VIVIANA CAMPODALLORTO; JUAN MANUEL LÁZARO MARTÍNEZ

Ciudad Autonoma de Buenos Aires

Jornada; JORNADA CIENTÍFICA - ACADEMIA NACIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA 2017; 2017

Academia Nacional de Farmacia y Bioquimica

El desarrollo de nuevos materiales económicos con alto valor agregado conlleva un gran desafío actual para hacer frente a problemas puntuales no sólo en el área medioambiental sino también en las áreas de química y biotecnología. En este contexto, la química macromolecular es de gran interés para producir materiales procesables con propiedades únicas y valiosas. Entre ellos, los polímeros ofrecen nuevas posibilidades a los científicos para la creación de materiales artificiales. En particular, nuestro grupo de investigación ha estudiado la incorporación de complejos de coordinación en arquitecturas poliméricas ya que abren la posibilidad de impartir las propiedades fisicoquímicas de ambos al material resultante. En los últimos años, los materiales poliméricos con ligandos quelantes tienen gran interés debido a sus aplicaciones industriales, tales como la eliminación de iones de metales pesados en efluentes y aguas contaminadas.1?4 Particularmente, los polímeros lineales de polietilenimina (PEI) presentan un amplio campo de aplicaciones, sin embargo, su importancia en el área de transfección en líneas celulares presenta una alternativa eficiente y econó a la utilización de vectores virales o reactivos comerciales. Por tal motivo y para profundizar el conocimiento de los factores estructurales presentes en polímeros de PEI que podrían comprender la eficiencia en procesos de transfección es que en el período 2015-2016 se llevó a cabo la síntesis de nuevos polímeros de PEI y se estudió la dinámica estructural, en términos de cristalinidad, en diversas muestras sintéticas de PEI teniéndose en cuenta su peso molecular, su forma química (clorhidrato: PEI.HCl o base libre= PEIbase-libre) como así también si los productos de PEI son cristalizados o liofilizados en diversas condiciones.La importancia de estudiar las formas sólidas radica en que los polímeros de PEI bajo la formaquímica de clorhidratos (PEI.HCl), como otros reactivos de transfección, pueden ser conservadosen su forma liofilizada por extensos períodos de tiempo sin pérdida de su actividad y reconstituirse de una manera rápida antes de su uso. Además, permite obtener valiosa información relacionada con la arquitectura polimérica que adoptan las distintas cadenas de PEI en el arreglo cristalino. Para ello, se llevaron a cabo estudios de RMN en estado sólido (ss-RMN) (Fig. 1). Los resultados obtenidos indican que las muestras cristalizadas del medio de reacción presentaron los porcentajes mayores de cristalinidad y una única señal a 42.9 ppm en los espectros de 13C-RMN CP-MAS, mientras que las muestras liofilizadas mostraron dos componentes a 42.9 y 44.4 ppm siendo esta última la asociada a regiones amorfas. A su vez, pudo evidenciarse la heterogeneidad estructural a partir de los experimentos 2D 1H13C HETCOR (Fig. 1G).5 La ss-RMN permitió comprender que la liofilización de diferentes soluciones acuosas de PEI causan el incremento de regiones amorfas incluso cuando algunos dominios cristalinos permanecen presentes, aunque en menor proporción en comparación con las muestras cristalizadas del medio de reacción. Esto pudo ser demostrado a partir de los experimentos de edición de los espectros de 13C CP-MAS y con la determinación de experimentos de polarización directa de 13C-RMN en el estado sólido. Por otra parte, la captación de iones cobre por parte de los polímeros de PEI produjo una significativa reducción de la movilidad molecular en las cadenas poliméricas produciéndose un material ordenado a partir de las mediciones de los tiempos de relajación transversal de 1 H (T2H) en donde se observa un decaimiento biexponencial en donde los tiempos cortos (~60 μseg) y largos (0.2-1 mseg) se asocian a regionescristalinas y amorfas, respectivamente (Fig. 1F). En particular las regiones amorfas presentaron un comportamiento diferente en cuanto al peso molecular asociado a un mayor desorden al aumentar el peso molecular. Es importante remarcar que el orden y rigidez producida en las cadenas lineales de PEI fue el resultado de la captación de un 3-4 %P/P y 40-52 %P/P de iones cobre y sulfato, respectivamente, de acuerdo con las mediciones de XPS, XRF y análisis elemental en los complejos de Cu(II)-PEI. La completa desorción de iones Cu(II) demostró que los iones sulfato son los responsables del alto grado de orden en términos estructurales tanto en los complejos de Cu(II) como en las muestras desorbidas del ión metálico (Esquema 1). Recientemente hemos profundizado el estudio estuctural en diversas formas sólidas de PEI mediante el empleo de técnicas de alta resolución en el estado sólido como ser como ser experimentos 1 H-MAS, 2D 1H1H SQ/DQ BaBa a una velocidad de rotación en el ángulo mágico (MAS) de 60 kHz como así también experimentos de 13C CP-MAS y 2D 1H13C HETCOR en conjunción con la determinación de los difractogramas de rayos-X de polvo, SAXS y WAXS.Por último, se estudió la eficiencia de transfección sobre diversas líneas celulares y en el desarrollo de nanosistemas con diversos materiales derivados de PEI. Los diversos polímeros de PEI mostraron buenos y superiores porcentajes de transfección en diversas líneas celulares en comparación con reactivos comerciales, demostrando que los PEI de alto peso molecular (87 y 217 kDa, tamaño de partículas 356 ± 4 y 670 ± 13 nm, respectivamente) mostraron una elevada eficiencia en la transfección de fibroblastos fetales bovinos de importancia para el desarrollo de animales transgénicos, a la vez que la citoxicidad pudo ser disminuía por el agregado de suero fetal bovino. En lo referido a la obtención de inmunosensores, la conjunción de PEI y nanopartículas de oro ofrece la posibilidad de obtener plataformas de sensores electroquímicos con notable amplificación de respuesta y óptima sensibilidad de calibrado. Se modificarán superficies conductoras mediante la electro-reducción de HAuCl4 en presencia de PEI.HCl. Las cadenas poliméricas serán activadas con el propósito de unir covalentemente diferentes proteínas de interés analítico, para el desarrollo de inmunosensores. Particularmente se utilizará seroalbúmina bovina (SAB) en la exploración de las condiciones óptimas de inmovilización. Posteriormente se inmovilizará la proteína GP120 correspondiente a la cápside del virus de inmunodeficiencia de simio, para la detección selectiva de anticuerpos en muestras biológicas. Se probarán diferentes métodos de transducción física del evento de unión, tales como voltametría de onda cuadrada (SWV) con sonda rédox, o espectroscopía de impedancia electroquímica (EIS) habitualmente empleada en sensores libres de marca.