Detección de IgA en materia fecal en bovinos destinada al diagnóstico de la paratuberculosis

GERMANI L; GUTIÉRREZ, B.A.3; ZURITA, M.E.3; DUARTE J; FERNÁNDEZ B.; CAPITELLI, G; MUNDO SL; JAR AM

Ciudad Autónoma de Buenos Aires

Jornada; XI Jornadas de Jóvenes Investigadores; 2022

CyT, Facultad de Ciencias Veterinarias, UBA

La paratuberculosis es una enteritis granulomatosa infectocontagiosa crónica y progresiva que afecta principalmente al ganado bovino, causada por Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (Map). El cultivo bacteriológico a partir de muestras de materia fecal tomadas de los individuos sospechosos posee una especificidad del 100% y está considerado como el método diagnóstico de referencia, pero posee una sensibilidad baja e insume hasta 6 meses. El objetivo del proyecto es desarrollar una prueba de ELISA destinada a detectar IgA anti-Map en materia fecal o en mucosa rectal. Nuestra hipótesis es que la respuesta inmune en intestino es continua aunque la presencia del antígeno sea intermitente. La mayor limitante de esta prueba es el nivel de IgA, que se estima en 0,24 mg/ml en fluido intestinal. Por esto, se está poniendo a punto un ELISA directo para IgA total, como requisito previo para poder detectar IgA específica. Se estudiaron siete bovinos residentes en la Facultad de Ciencias Veterinarias. Se estandarizaron los procedimientos de toma de muestras de materia fecal e hisopado de mucosa rectal: el braceo rectal se realizó hasta la altura del pubis; la materia fecal se extrajo con el guante de examinación, mientras que para la toma de muestra de mucosa se utilizó un hisopo estéril de 73 cm de largo con tubo exterior y tapa. Las muestras se procesaron en forma inmediata. Se realizaron dos suspensiones de 1g/mL y 2 g/mL de materia fecal en PBS con 0,02% de EDTA que se centrifugaron tres veces en forma sucesiva (15 min a 2500 rpm, 15 min a 10000 rpm y 10 min a 10000 rpm). El material extraído con el hisopo se resuspendió con 1 mL de PBS con 0,02% de EDTA y se centrifugó a temperatura ambiente durante 10 min a 2500 rpm. Los sobrenadantes obtenidos se analizaron por ELISA directo. Se utilizaron placas Microlon® (GBO) que se sensibilizaron con 50 µl de los sobrenadantes en dilución 1:2 en buffer carbonato-bicarbonato, durante 1 hora a 37°C; se bloqueó con 10% de leche descremada en PBS. La presencia de IgA (abcam) en las muestras se identificó con un anticuerpo comercial anti-IgA bovina conjugada con peroxidasa en dilución 1:10000; la reacción se reveló con TMB, se frenó con ácido sulfúrico 0,2 M y se leyó a 450 nm. Los valores obtenidos de D.O. son variables de un animal a otro y oscilan entre 0.100 y 0.700. No se detectaron diferencias significativas entre las distintas metodologías de obtención de muestras para cada animal (p=0.93 por Chi-cuadrado y test de Kruskal-Wallis). Los resultados obtenidos son preliminares, pero de confirmarse podrían sugerir que la toma de materia fecal fresca sería suficiente para el diagnóstico y menos invasiva para el animal. Se espera poder desarrollar una prueba de ELISA para IgA específica, que podría utilizarse como una prueba diagnóstica para la identificación de la paratuberculosis.