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Introducción: En los últimos años las nanopartículas de hierro han cobrado alto interés en campos como la medicina, la informática, textiles, plásticos, etc. Las nanopartículas pueden llegar al ambiente, con potencial impacto sobre la salud ambiental y humana. Se considera que el mecanismo citotóxico más importante que inducen los nanomateriales se relaciona con la generación de ROS, pudiendo derivar en procesos de estrés oxidativo. El análisis de la capacidad antioxidante total (TOSC) ha demostrado ser una herramienta fiable para evaluar cuantitativamente la resistencia biológica a la toxicidad de ROS. Este método se basa en la capacidad de los antioxidantes celulares para reducir la oxidación del ácido α-ceto-γ-metilbutírico (KMBA) a etileno en presencia de oxi-radicales generados artificialmente. La formación de etileno, que es parcialmente inhibida por la presencia de antioxidantes, es monitoreada por GC (Winston et al 1998). Las lombrices son consideradas excelentes organismos para el monitoreo biológico de contaminantes del suelo (bioindicadores), por su rol en la incorporación y descomposición de materia orgánica que favorecen el desarrollo y mantenimiento de la estructura del suelo. El ensayo de toxicidad en lombrices empleando el método del papel impregnado, resulta útil para evaluar la toxicidad de los compuestos que pudiesen llegar al compartimiento suelo. Respuestas biológicas que ocurran a concentraciones subletales pueden resultar parámetros más relevantes. Entre ellos, TOSC es un índice integrador para monitorear el impacto de los contaminantes ambientales sobre las funciones celulares. Objetivos: Puesta a punto y evaluación de la capacidad antioxidante total (TOSC) contra peroxilos de material biológico en lombrices expuestas a nanopartículas de Fe2O3, utilizando la técnica espacio cabeza y cromatografía gaseosa. Materiales y Métodos: Material biológico Lombrices Eisenia andrei adultos, con clitelo desarrollado, de al menos tres meses de edad y pesos comprendidos entre 300-600 mg. Partículas Se utilizaron dos tipos de partículas de óxido férrico (Fe2O3): nanopartículas (tamaño promedio < 30nm) y partículas convencionales (tamaño promedio < 5 µm). Sigma-Aldrich, Argentina. Bioensayos de exposición Se procedió de acuerdo con la guía OECD N° 207, utilizando la técnica del papel impregnado. Lombrices adultas (5 ejemplares/tratamiento) fueron expuestas durante 72 hs a papeles de filtro impregnados con suspensiones acuosas de las partículas (50 y 100 µg/cm2), en viales de vidrio y se almacenaron a -80 ºC hasta su procesamiento. Paralelamente se llevó un control con lombrices expuestas a papeles impregnados sólo con agua. Preparación de homogenatos y determinación de proteínas Entre 3 y 5 lombrices por tratamiento fueron homogeneizadas (1:3 w/v) en buffer TRIS-Cl 100 mM, pH 7.5. Los homogenatos se centrifugaron a 9.000 g 30 min (4 ºC). Las proteínas se determinaron por la técnica espectrofotométrica de Bradford (1976). Evaluación de TOSC Se determina la cantidad de etileno liberada, por oxidación del KMBA, en relación al blanco en presencia y ausencia de muestras biológicas. Los radicales peroxilo se originaron por descomposición térmica del dihidroclorhidrato de 2-2'-azo-bis-(2 metilpropionamidina) (ABAP) a 37°C en buffer fosfato de potasio 100mM, pH 7,4 (Regoli and Winston 1999). Viales de 10 ml conteniendo 0,8 ml de KMBA (0.2 mM), 0,1 ml de ABAP (cf. 20 mM) y 0,1 ml de homogenato se incubaron a 37 ºC. El etileno producido fue determinado por cromatografía gaseosa tomando alicuotas de 0,5 ml del espacio de cabeza de cada vial, cada 15 minutos durante un período de 90 minutos. El etileno generado en los viales fue determinado en un cromatógrafo gaseoso Hewlett Packard (HP 6890 Serie N) con detector de ionización de llama empleando una columna Supelco Q-PLOT (30m x 0.53 mm). La temperatura del inyector fue de 180 ºC y la del detector de 250°C. Se empleó nitrógeno como gas carrier a un flujo de 4,7 ml/min. El horno se programó a 35 °. La duración de la corrida fue de 6 minutos. La capacidad antioxidante total fue cuantificada por diferencia entre las áreas bajo las curvas obtenidas para el blanco y las muestras. Análisis estadístico de los resultados El área bajo las curvas se determinó mediante el ajuste polinómico de los datos. Los datos fueron analizados utilizando ANOVA de una vía y test de Tukey o métodos no paramétricos según corresponda. Resultados y Conclusiones Se observó que tanto los organismos expuestos a las partículas convencionales como los controles presentaron niveles similares de TOSC. Los organismos expuestos a las nanopartículas, en cambio, disminuyeron su capacidad antioxidante en un 20% y 28% respectivamente para ambas concentraciones. El análisis de estos resultados preliminares demostró que el método utilizado puede ser una herramienta robusta y versátil para la evaluación de efectos antioxidantes en tejidos biológicos para evaluar el impacto de las nanopartículas que pueden ser liberadas al ambiente. Agradecimientos: CONICET y ANPCyT.

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