Rab11-FIP2, una proteína de interacción con la GTPasa Rab11, se recluta a la membrana de la inclusión de Chlamydia trachomatis.

LEIVA N; CAPMANY A; DAMIANI MT

Mendoza. Argentina

Jornada; Jornadas de Investigación 2010; 2010

Facultad de Ciencias Médicas. UNCuyo

Las células internalizan microorganismos mediante un proceso llamado fagocitosis. El fagosoma formado es una vesícula cuya composición cambia rápidamente. La remodelación de la membrana y contenido del fagosoma temprano conduce a su maduración y fusión con lisosomas para convertirse en un fagolisosoma degradativo. Las proteínas Rabs (GTPasas monoméricas de bajo peso molecular) cumplen un papel clave en el transporte mediado por vesículas. Estas GTPasas son interruptores moleculares que ciclan entre un estado activo (GTP) y uno inactivo (GDP). Resultados obtenidos en nuestro laboratorio demuestran que Rab11 favorece la fagocitosis y es necesaria en forma activa para un eficiente reciclaje desde el compartimiento fagocítico. Se ha descripto que Rab11 se recluta a la membrana de la inclusión de Chlamydia trachomatis. Esta bacteria es intracelular obligada y reside en una vacuola no acídica, no degradativa llamada inclusión. Esta vacuola se excluye de la vía endocítica e intercepta vesículas provenientes del TransGolgi ricas en esfingolípidos. Tenemos evidencias que el reclutamiento de Rab11 a la inclusión de Chlamydia trachomatis depende de la síntesis activa de proteínas bacterianas. Además, Rab11 en su estado activo es necesaria para el desarrollo de la inclusión intracelular, dado que la sobreexpresión de la mutante negativa unida a GDP de Rab11 (Rab11S25N) disminuye significativamente el tamaño de la inclusión donde se multiplica esta bacteria. Recientemente, se ha descrito una familia de proteínas RCP/Rip/FIPs capaces de interaccionar con Rab11 por un dominio conservado en su extremo C-terminal llamado RBD (Rab Binding Domain). Hemos demostrado que uno de sus miembros, RCP, participa juntamente con Rab11 en el transporte en la vía fagocítica. Nuestro objetivo fue estudiar una posible asociación de las proteínas pertenecientes a la familia RCP/Rip/FIPs de interacción con Rab11 a la inclusión de C. trachomatis. Entre las proteínas analizadas, observamos que FIP2 (Rab11-Family Interacting Protein-2) se recluta en forma específica a la inclusión clamidial. La proteína FIP2, además del dominio RBD de unión a Rab11, posee un dominio C2 con afinidad por fosfolípidos de membrana. Al infectar con Chlamydia trachomatis células HeLa que sobreexpresan FIP2, se observó un reclutamiento diferencial según el tiempo de desarrollo de la infección. Este reclutamiento ocurre tempranamente (figura 1A) y permanece las primeras 24 hs pi (Figura 1B). La mutante de FIP2 que carece del dominio RBD de unión a Rab11 (FIP2∆C2∆RBD) presenta un patrón citosólico sin reclutamiento a la membrana de la inclusión. Por el contrario, la mutante de FIP2 que carece solamente del dominio C2 de unión a fosfolípidos (FIP2∆C2) decora intensamente dicha inclusión (Figura 1 A y B). Las vacuolas que contienen Chlamydias se fusionan para generar una única inclusión. Sin embargo, se ha observado la existencia de más de una inclusión en las células que expresan FIP2, tanto por microscopía confocal como microscopía electrónica. Estos hallazgos sugieren que la presencia de FIP2 en la membrana de la inclusión interferiría con el proceso de fusión homotípica de vacuolas conteniendo bacterias. El reclutamiento de FIP2 depende de la síntesis de proteínas bacterianas, ya que es inhibido por tratamiento con cloramfenicol (Figura 2A). Tampoco se evidencia reclutamiento de FIP2 a la inclusión cuando las células infectadas se incuban a la temperatura de 32°C. Esta temperatura bloquea el transporte y exposición en la membrana de la inclusión de algunas proteínas sintetizadas por la bacteria como IncA. Estos resultados indican que una proteína bacteriana, cuya exposición en la membrana es sensible a la temperatura, es necesaria para la asociación de FIP2 a la inclusión de Chlamydia (Figura 2B). Al presente, se ha descrito y caracterizado en la literatura el reclutamiento de una única ?Rab interacting protein? de la célula hospedadora llamada BICD1 a la inclusión de Chlamydia trachomatis. Esta proteína BICD1 es un efector de Rab6, pero se recluta a la inclusión en forma independiente de la presencia de la Rab. Es por ello, que nos interesó estudiar si el reclutamiento que observamos de FIP2 a la inclusión era mediado por su interacción con Rab11. Para ello se desarrollaron diferentes estrategias como la utilización de una mutante de FIP2 con el dominio de unión a Rab11 delecionado o la sobreexpresión de mutantes negativas de Rab11 que no se reclutan a la inclusión como Rab11S25N. Al co-transfectar células HeLa con plásmidos que codifican para la proteína RFP-Rab11 (rojo) y para la proteína GFP-FIP2 o alguna de sus mutantes (verde), se observa que FIP2 y la mutante que mantiene el dominio RBD (FIP2∆C2) colocalizan con Rab11. Por el contrario, la mutante que carece del dominio RBD de unión a Rab11 (FIP2∆C2∆RBD) no se  asocia a la membrana de la inclusión (Figura 3A). Se corroboró que el reclutamiento de FIP2 a la inclusión es a través de su interacción con Rab11 infectando células HeLa co-transfectadas con FIP2 y la mutante negativa de Rab11 (Rab11S25N). La GTPasa Rab11 en su forma inactiva unida a GDP (Rab11S25N) no se recluta a la membrana de la inclusión, y nuestros resultados mostraron que FIP2 tampoco se asocia a la membrana de la inclusión en esa situación (Figura 3B).  Estos resultados implican que la asociación de FIP2 a la inclusión de Chlamydia es a través de su interacción con Rab11 mediada por el dominio RBD. Estos resultados aportan nueva evidencia de la manipulación que realiza C. trachomatis de las vías de transporte de la célula hospedadora.