Proyecto efecto de la suplementación con resveratrol y/o trolox sobre la preservación de semen y oocitos porcinos

STEPHANIA MADRID GAVIRIA; SERGIO MORADO; SILVINA FERNÁNDEZ; PABLO CETICA; MARIANA CÓRDOBA

Jornada; X Jornadas de Jóvenes Investigadores; 2021

El uso de biotecnologías reproductivas y la conservación de gametos presentan un reto mayor en los porcinos ya que los mismos son más sensibles al daño por frío, debido a la composición lipídica de los espermatozoides y al alto contenido de lípidos en los oocitos. Para mejorar la eficiencia de estas técnicas se ha propuesto el uso de antioxidantes los cuales pueden tener un efecto protector. El objetivo de este proyecto será determinar el efecto de la suplementación con Resveratrol (Rv) y/o Trolox (Tx) sobre la refrigeración del semen y la vitrificación de oocitos porcinos. Para esto se recolectarán complejos cúmulos-oocitos inmaduros a partir de ovarios de hembras faenadas los cuales serán madurados in vitro durante 48 horas siguiendo un protocolo estándar, posteriormente serán denudados y se considerarán maduros aquellos oocitos que presenten el primer cuerpo polar. Los oocitos maduros serán vitrificados mediante el método de mínimo volumen Cryotech®, durante el cual las soluciones de vitrificación y atemperado (control) serán suplementadas con Rv y/o Tx. Luego de la vitrificación-atemperado se evaluará la producción de ROS en los oocitos mediante la tinción de 5 µM de 2’,7’-diclorodihidrofluoroseina diacetato y las mitocondrias activas mediante la tinción de Mitotracker Green. Para las evaluaciones se utilizará un microscopio de epifluorescencia y se obtendrán imágenes de las cuales se analizará la intensidad de fluorescencia mediante el software IMAGE J. En cuanto al semen porcino, las muestras obtenidas serán diluidas con diluyente comercial (control) el cual será suplementado con Rv y/o Tx y serán refrigeradas a 17°C durante 4 días. Al finalizar este período se evaluará la motilidad progresiva mediante observación en microscopio, la viabilidad e integridad acrosomal mediante tinción de azul tripán y DIC, nivel de capacitación espermática utilizando el ensayo de clorotetraciclina y se evaluará de manera simultánea el potencial de membrana mitocondrial y las especies reactivas de oxígeno mitocondriales utilizando las tinciones JC-1 y MitoSOX Red, respectivamente. Finalmente, se evaluará la funcionalidad de los gametos utilizando la fecundación in vitro; la capacidad fecundante del semen refrigerado con los antioxidantes se evaluará mediante co-incubación con oocitos frescos madurados in vitro, mientras que la capacidad de ser fecundados de los oocitos vitrificados-atemperados con antioxidantes se evaluará mediante co-incubación con semen fresco. Se espera que la suplementación de los medios de vitrificación-atemperado de oocitos o del diluyente para refrigeración de semen porcino con Rv y/o Tx favorezca la tolerancia de los gametos al daño por frío, disminuya el estrés oxidativo, mantenga el nivel de actividad mitocondrial y conserve la capacidad fertilizante del semen y de los oocitos de ser fecundados.