PEGILACION DE GALACTOSIDASA-ALFA RECOMBINANTE HUMANA (RH-aGAL) EMPLEANDO PEG-BUTIRATO DE NHS

MENEGON, MALEN; RODRÍGUEZ, MARÍA CELESTE; VAILLARD, VICTORIA; CEAGLIO, NATALIA; VAILLARD, SANTIAGO

Posadas

Simposio; 6º Simposio Argentino de Procesos Biotecnológicos (SAPROBIO); 2021

Universidad Nacional de Misiones

La bioconjugación con metoxi-polietilenglicol (mPEG), o PEGilación, puede corregir varios inconvenientes asociados al uso terapéutico de proteínas recombinantes y de otros biofármacos1. Las drogas conjugadas a mPEG exhiben mejoras en sus propiedades químicas, bioquímicas y farmacológicas y un comportamiento in vivo mucho más favorable2.En la actualidad se encuentra en estudio clínico de fase III una versión PEGilada de rhα-Gal producida en células de tabaco (PRX-102, PEGunigalsidasa alfa®)3, donde se emplea PEG homo-bifuncional de 2 KDa en exceso, conduciendo a un bioconjugado muy heterogéneo, en el que las subunidades de la enzima se encuentran entrecruzadas de forma covalente. El objetivo de este trabajo es estudiar la conjugación de rhα-Gal producida en células CHO-K1 empleando mPEG mono-funcional de elevado peso molecular que no conduce al entrecruzamiento de las subunidades enzimáticas.Para ello, en primer lugar se determinó la actividad enzimática (AE) de la enzima pura, la que se empleó como producto de partida, obteniendo un valor de 1,01E+06 (U.mg-1). Luego se llevaron a cabo las reacciones de PEGilación con mPEG-NHS butirato de 30 KDa (mPEG-SBA), en PBS pH 8,0 a 25 °C, en una relación molar rhα-Gal:mPEG 1:10. Tanto la enzima como las reacciones de conjugación se evaluaron por SEC-HPLC con detección a 280 nm y por SDS-PAGE. Con el objetivo de optimizar la reacción de conjugación se tomaron alícuotas a distintos tiempos y se analizaron por SDS-PAGE. Además, se midió la AE remanente en el crudo de reacción, sin observar cambios en su valor. En estas condiciones, se alcanzó conversión completa de rhα-Gal luego de 6 h de reacción a expensas de la formación de un 60% de productos diPEGilados. La formación de productos monoPEGilados, que otorgan homogeneidad al producto, alcanzó un máximo del 40% luego de 20 min. A partir de ese momento, sólo se observó el incremento de productos de sobre-PEGilación, por lo que se estableció como tiempo óptimo un período de 20 min. Luego de la conjugación, se comenzó la puesta a punto de la purificación del conjugado. La optimización se basó en el uso de la metodología empleada para purificar rhα-Gal a partir de sobrenadantes de cultivo4 teniendo en cuenta los cambios esperados en las propiedades de la proteína, principalmente carga e hidrofobicidad. En primer lugar, se realizó una cromatografía de intercambio aniónico (IEX), en la que se logró separar la proteína libre y la fracción conjugada del exceso de mPEG-SBA remanente en el crudo de reacción, que podría interferir en la siguiente etapa5. Como segundo paso de purificación, se empleó una resina de interacción hidrofóbica (HIC), observándose un enriquecimiento de la proteína PEGilada en relación a la proteína no PEGilada en las primeras fracciones de elución. Si bien hasta el momento aún no se han podido separar completamente ambas especies, estudios preliminares indicarían que la AE de la proteína conjugada no diferiría con respecto al producto de referencia ni a la versión en evaluación clínica, aunque exhibiría un carácter más homogéneo, lo que resulta una propiedad altamente deseable en un desarrollo de tecnología de PEGilación.