Un esquema mejorado para la purificación de la PCL de hígado de rata.

CHAUFAN G.,; IGLESIAS S.,; SAN MARTÍN DE VIALE L.C.,; RÍOS DE MOLINA M. C.

Villa Carlos Paz, Córdoba. Argentina

Congreso; Reunión Nacional de la Asociación Argentina de Investigaciones Bioquímicas. SAIB XXIX.; 1993

Asociación Argentina de Investigaciones Bioquímicas. SAIB

Se presenta un esquema mejorado para lapurificación de la porfirinógeno carboxi-liasa, enzima clave de la acción de los hidrocarburos aromáticos polihalogenados.             Se contruyó una columna de afinidad, inmovilizando el sustrato oxidado sobre Sepharosa 4B. Se estandarizaron las condiciones de uso: carga (30 mg de prot/ml de gel), siembra (sembrado y resembrado), lavado (hasta A280 0.01), elusión (con gradiente de ClK 0-0.4 M en buffer fosfato de potasio 0.1 M pH 6.8). De esta manera se logró igual grado de purificación (75 veces) y mayor rendimiento que el obtenido anteriormente con el empleo secuencial de 3 columnas distintas (DEAE-celulosa, Sephacryl S-200 y Phenil Sepharosa): Como paso final (preparación homogénea) e realizó una columna de Sephadex G-75.             Se determinó y compró la actividad recuperada desde discos de electroforesis, por distintas técnicas (elusión, triturado y determinación “in situ”). Los resultados fueron ligeramente mejores con la técnica del triturado. Al pder asegurar así la/s banda/s activa/s podrá asegurarse también la electroforesis en gel de poliacrilamida como último paso e inclusive, utilizar el gel cargado para la producción de anticuerpos. Por otra parte la electroforesis en gel de poliacrilamida reveló 2 bandas, en los tubos de máxima actividad de la columna de afinidad, pero solo una con actividad PCL. Teniendo en cuenta la posible existencia de isoenzimas estas dos vandas podrían corresponder a ellas (asumiendo que una de ellas es mucho menos activa) o de lo contrario, la de menor PM podría se un producto de degradación inactivo o un contaminante con características muy semejantes a la PCLo fuertemente asociado a ella.