Expresión heteróloga, purificación y caracterización del ALAD recombinante humana.

VARELA, L.; ROSSI, J.P; BATLLE A.; GEREZ, E

Mar del Plata, Argentina

Congreso; Sociedad Argentina de Investigacon Clinica (SAIC). LII Reunión Científica Anual; 2007

Sociedad Argentina de Investigación Clínica

El primer paso común de la biosíntesis del hemo, es la condensación asimétrica de dos moléculas de ALA, catalizada por la enzima d-aminolevulinato dehidratasa (ALAD) (E.C.4.2.1.24). Esta enzima de 280 kDa, está compuesta por ocho subunidades idénticas. Estudios realizados en una población diabética demostraron que la actividad del ALAD está disminuida en sangre de diabéticos respecto a los controles normales. Los mecanismos moleculares que llevan a la inactivación del ALAD podrían deberse a la glicación no enzimática del residuo de lisina del sitio activo que forma una base de Schiff con la primer molécula de ALA, o a la oxidación de los residuos cisteína esenciales para la actividad enzimática. Una hipótesis complementaria es la combinación de ambos fenómenos (glicooxidación). El objetivo de este trabajo fue la obtención y caracterización del ALAD humana (ALADh) recombinante in vitro. A partir de sangre humana se aisló el ARN total y por la técnica de RT-PCR se obtuvo el ADNc del ALADh. El ALADh se clonó en el plásmido pGEX-3X y se sobreexpresó en la cepa de Escherichia coli BL21 como una proteína de 62 kDa fusionada a un fragmento de 26 kDa de la glutatión-S-transferasa. Para ello se indujeron cultivos de E. coli BL21 con 0.1mM IPTG a temperatura ambiente con crecimiento durante la noche. La actividad residual de la proteína recombinante se determinó a distintas temperaturas: 4, 25, y 37ºC, siendo la vida media de 44.5, 10.6 y 2.14 días respectivamente. A mayores temperaturas: 45, 55 y 65ºC se observó un aumento de la actividad enzimática de hasta un 60% (control: 49,14 ±15,00). La proteína recombinante se purificó a homogeneidad por columna de afinidad obteniéndose una proteína activa. Con esta ALADh recombinante, de elevada actividad específica y pureza se harán estudios estructurales y cinéticos y se determinará cual es el mecanismo de inactivación enzimática.