Validación de sondas fluorescentes para la identificación de propionibacterias clásicas mediante FISH

BABOT, J; HIDALGO, VM; LORENZO PISARELLO, MJ; PÉREZ CHAIA, AB; APELLA, MC

REVISTA CHILENA DE NUTRICíON

Sociedad Chilena de Nutrición, Bromatología y Toxicología

Año: 2009 vol. 36 p. 676 - 676

0716-1549

Las propionibacterias son responsables de la apertura de la masa y del sabor y aroma de diversos quesos. La fermentación propiónica ha sido explotada para la manufactura de pan y productos vegetales fermentados para consumo humano. En la identificación de estas bacterias se han aplicado por años sólo criterios bioquímicos, pero estos análisis solo permiten la identificación de bacterias cultivables. La técnica de Hibridización Fluorescente In Situ (FISH) detecta secuencias de ácidos nucleicos utilizando sondas, marcadas con un compuesto fluorescente, que hibridizan específicamente a su secuencia blanco complementaria dentro de una célula intacta. Esta metodología no se ha descrito aún para propionibacterias lácteas, lo que resulta de gran interés biotecnológico y constituye el objetivo de este trabajo. Para esto, se diseñaron tres sondas: Pap, Pj y Pfr específicas para P. acidipropionici, P. jensenii y P freudenreichii, respectivamente. El método incluye cuatro etapas: fijación, permeabilización, hibridización y lavado. En el primer paso se analizaron dos protocolos de fijado, con y sin paraformaldehído. En el paso siguiente, se estudiaron distintas concentraciones de lisozima (0,1; 0,5; 1 y 5mg/ml), tiempos (5; 10 y 15 minutos) y temperaturas de incubación (4; 25 y 37ºC). Mientras que en la etapa de hibridización, se probaron diversas temperaturas (37; 45; 50; 55; 60 y 70ºC). Las condiciones óptimas para la metodología utilizada son las que incluyen paraformaldehído, incubación con lisozima 1mg/ml durante 10 minutos a 25ºC y temperatura de hibridización de 45ºC para P. acidipropionici y P. freudenreichii, y  50ºC para P. jensenii.