Determinación de la Identidad en la Agricultura y Efectos Colaterales

CASTAGNARO, A.; PERERA, F. ; RACEDO, J.; PARDO, M.; SENDÍN, L.; ROCHA, C.; ORCE, I.; SICILIANO, F.; GARCÍA, M.; GONZALES, V.; FOGLIATA, G.; SALAZAR, S.; ONTIVERO, M.; FILIPPONE, M.; ARIAS, M.; PLOPER, D. ; MARANO, M.; VOJNOV, A.; DIAZ RICCI, J.

Análisis de Semilla

Revista Análisis de Semillas

Año: 2011 vol. 2 p. 43 - 46

1851-1678

No sólo por la producción de alimentos la agricultura se inmiscuye en casi todos los órdenes de la vida en sociedad. Así como la agricultura es uno de los inventos clave que posibilitó el desarrollo social moderno al permitir que las poblaciones sedentarias reemplacen a las nómades, en este artículo se describen algunos ejemplos de investigaciones agronómicas tendientes a la identificación de plantas y microorganismos relacionados con las mismas, que han tenido además de los resultados buscados, en algunos casos, implicancias en campos de aplicación de las ciencias sociales. En el año 2002 mediante un convenio entre el Instituto Superior de Investigaciones Biológicas (INSIBIO; Conicet - UNT) y la Estación Experimental Agroindustrial Obispo Colombres (EEAOC), se puso en marcha la Sección Biotecnología con el objetivo principal de desarrollar y adaptar tecnologías para apoyar programas institucionales preexistentes tendientes a incrementar con sostenibilidad, la productividad de agroindustrias como la sucro-alcoholera, sojera, citrícola y frutillera. Se trató de una iniciativa original en Argentina que pretendió sacar provecho del amplio espectro de oportunidades que ofrece la biotecnología para aumentar la productividad de forma económica, social y ambientalmente más segura, a través del desarrollo de biopesticidas, de las técnicas de cultivo de tejidos y micropropagación, de la transformación genética propiamente dicha, y del análisis genómico asociado al mejoramiento genético y al diagnóstico de enfermedades mediante la utilización de marcadores moleculares. El avance de la biología molecular y especialmente de las técnicas que permiten manipular, recombinar, reprogramar o alterar la molécula de ADN, ha permitido el desarrollo de marcadores moleculares (MM), los cuales se han constituido en las herramientas más utilizadas para el análisis genómico y por ende, en la determinación de identidad. Los MM son fragmentos específicos de ADN distribuidos en el genoma y que pueden o no estar asociados a genes que codifican un producto biológico funcional. Los más modernos se basan en la amplificación de ADN por la técnica de PCR (siglas del inglés de ?Polymerase Chain Reaction?) y se caracterizan porque su detección es fácil y rápida. Su uso está revolucionando el mejoramiento genético convencional, aportando herramientas genómicas que pueden utilizarse en la selección asistida para acelerar el desarrollo de nuevos cultivares. En comparación con los caracteres morfológicos, fisiológicos y fenotípicos en general, los MM (o genotípicos) son altamente polimórficos, reproducibles, están distribuidos de manera uniforme por todo el genoma, no están sujetos a las condiciones ambientales ni al estado fisiológico de los organismos estudiados, y su detección resulta cada vez más económica. A continuación se citan ejemplos de lo anunciado anteriormente, haciendo la aclaración que nuestro laboratorio está conformado por una red de grupos que no sólo están en Tucumán, sino también en Rosario de Santa Fe y Buenos Aires: (i) Por un lado, los MM están siendo usados en nuestro laboratorio con la finalidad de asistir a los programas de mejoramiento genético de Caña de Azúcar (PMGCA), Soja y Citrus de la EEAOC. A través de ellos se establecieron las primeras ?huellas moleculares? genotípicas con las que se pudo identificar inequívocamente clones, variedades, líneas y/o cultivares, caracterizar progenitores, estudiar el comportamiento de caracteres moleculares específicos en poblaciones de mapeo y estimar la diversidad genética (Fontana et al., 2003; Perera et al., 2009; Rocha et al., 2007). Muy recientemente, mediante el análisis del modo de herencia (heredabilidad) de un tipo de MM microsatélites, hemos evaluado la efectividad de una técnica de emasculación (esterilización del polen por inmersión de las panojas en agua caliente) utilizada en el PMGCA. Esta aproximación también nos está posibilitando determinar el grado de hibridez que se consigue en cruzamientos dirigidos, así como los niveles de autofecundación (Perera et al., 2010). En el caso del Programa Citrus, se están utilizando los MM para identificar los portainjertos liberados al cultivo comercial por la EEAOC después de más de 40 años de trabajo, diferenciándolos entre sí y de los progenitores que les dieron origen. En el Programa de Mejoramiento Genético de la Soja (EEAOC), la generación de estas herramientas moleculares nos está permitiendo aumentar la eficiencia en los cruzamientos orientados a la obtención de nuevas líneas de alto potencial productivo, aún en agroecosistemas marginales (con frecuente estrés hídrico). También en soja y a través de la comparación de perfiles moleculares, hemos actuado como Auxiliares de la Justicia en la determinación de la identidad de semillas de soja supuestamente comercializadas en forma ilegal como ?bolsa blanca?, sin certificado de origen y calidad (Oficio Nº 2514 del 12 de diciembre de 2001). Con el objetivo de automatizar y por ende, agilizar el proceso de generación de MM, nuestro laboratorio ha adquirido recientemente un equipo 4300 DNA Analyser de Li-cor, basado en una tecnología de detección de alta sensibilidad de fluorescentes infrarrojos. Actualmente, se ha optimizado su uso para caracterizar genotípicamente poblaciones de mapeo en soja y caña de azúcar, y posteriormente asociar los MM obtenidos con características de interés agronómico. Esto permitirá asistir a los programas de mejoramiento genético disminuyendo los tiempos para la obtención de nuevas variedades. (ii) Por otra parte, los MM son indispensables para asistir al Proyecto Vitroplantas de Caña de Azúcar de la EEAOC. Este Proyecto provee al sector productivo de caña ?semilla? de pureza genética y sanidad garantizada, obtenida mediante la técnica de cultivo de meristemas y micropropagación in vitro. En nuestro laboratorio se lleva a cabo la primera etapa donde se producen aproximadamente 40.000 plantines anuales de las principales variedades comerciales de caña de azúcar, los cuales son multiplicados posteriormente en una red de semilleros ubicados a lo largo del área cañera de la Provincia de Tucumán. Con este emprendimiento ya se ha reemplazado más del 60% de la superficie cultivada con caña de azúcar, lo que ha tenido su correlato en el sostenido incremento de la producción azucarera de la Provincia desde la implementación del Proyecto. Tanto las plantas madres donadoras de meristemas como los plantines micropropagados se evalúan sanitariamente mediante técnicas sensibles, rápidas y reproducibles de diagnóstico molecular. Hemos optimizado el protocolo de diagnóstico de dos enfermedades bacterianas: el raquitismo de la caña soca (Leifsonia xyli sp. xyli) y la escaldadura de la hoja (Xanthomonas albilineans), y tres enfermedades ocasionadas por virus: el mosaico de la caña de azúcar provocado por al menos dos virosis: Sugarcane Mosaic Virus o SCMV y Sorghum Mosaic Virus o SrMV, el mosaico estriado de la caña de azúcar (Sugar Cane Streak Mosaic Virus, SCSMV) y el síndrome de la hoja amarilla (Sugarcane Yellow Leaf Virus, ScYLV). Esta tecnología también se emplea en la evaluación sanitaria durante el período de cuarentena al que son sometidos los genotipos progenitores que se incorporan desde el extranjero para incrementar la diversidad genética del PGMCA, con el objetivo de evitar la introducción de nuevos patógenos (Filippone et al., 2006; Paz et al., 2008). El aseguramiento de la pureza genética se realiza mediante análisis fenotípico (visual) y genotípico (MM) de la ocurrencia de variación somaclonal, es decir de modificaciones genéticas (cambios en la secuencia del ADN) o epigenéticas (cambios en la expresión del ADN) que aparecen asociadas al cultivo de tejidos y constituyen el principal inconveniente de la micropropagación masiva. En este sentido, se ajustó un protocolo a través del cual se obtienen ?perfiles moleculares? para cada una de las líneas micropropagadas: aquellas líneas que hayan sufrido alteración en la secuencia o en la expresión de su ADN se detectan a través de la comparación de sus perfiles moleculares con los obtenidos previamente para cada una de las variedades en estudio propagadas en forma convencional (Paz et al., 2008; Sepúlveda Tusek et al., 2008). (iii) Además y como se mencionó con anterioridad, estamos empleando MM para realizar estudios poblacionales de los patógenos (bacterias, virus y hongos) y plagas de insectos que afectan más negativamente a nuestros cultivos, no sólo porque reducen drásticamente el rendimiento sino porque pueden ser agentes etiológicos cuarentenarios (patógenos que no se encuentran en países compradores) que afectan la comercialización (exportación): -Se determinó que la enfermedad del moteado del limonero es causada en Tucumán por una especie de hongo del género Guignardia (G. mangiferae) que no es cuarentenaria, en lugar de Guignardia citricarpa que si lo es y es responsable de producir la enfermedad de la mancha negra (Fogliata et al., 2004). -La cancrosis de los cítricos es la otra enfermedad cuarentenaria en la que se investigó la diversidad genética de su agente causal, la bacteria Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac). Con este propósito se llevó a cabo una extensa caracterización fenotípica y molecular de aislados provenientes de distintas regiones productoras del noroeste argentino (Siciliano et al., 2006). Dicho estudio permitió encontrar una variante bacteriana de virulencia reducida que induce la respuesta defensiva de la planta. A partir de este genotipo de Xac, en la actualidad se investiga la posibilidad de generar un bioproducto para un manejo más sustentable de la enfermedad. -Una enfermedad devastadora de los cítricos es el HLB (Huanglongbing) o ex greening; esta patología es ocasionada por la bacteria Candidatus liberibacter spp. que se transmite a la planta a través de un insecto vector que se encuentra en zonas productoras de Argentina. Por este motivo, desde que fue detectada en Brasil en 2004 se ha constituido en una verdadera amenaza para la citricultura de nuestro país, por lo que se están haciendo grandes esfuerzos tendientes a prevenir el ingreso del patógeno. Una de las principales medidas que hemos llevado a cabo en nuestro laboratorio, fue optimizar diversas aproximaciones basadas en PCR para poder realizar un diagnóstico certero y confiable, aún con una muy baja carga patogénica tanto en el vector como en la planta. -Otro estudio poblacional pero con importancia para la actividad azucarera, fue la caracterización de los virus asociados con el mosaico de la caña de azúcar, una de las principales enfermedades sistémicas de este cultivo. Los resultados revelaron que en Tucumán la enfermedad es provocada como en otras zonas azucareras del mundo por el SCMV y por el SrMV, pero que a diferencia de las áreas productoras de Salta y Jujuy, en nuestra Provincia existe un alto índice de coinfección de ambas virosis en la misma parcela y en la misma planta. La técnica de MM empleada permitió establecer nueve perfiles diferentes del virus del mosaico de la caña de azúcar y tres del virus del mosaico del sorgo. Sin embargo, cuando se determinó la secuencia exacta de nucleótidos de un fragmento del gen de la proteína de la cápside viral de aislados dentro de cada perfil molecular, se encontró una diversidad mayor a la esperada y a la encontrada en otras y más grandes regiones cañeras del mundo (Perera et al., 2009). El claro conocimiento de los agentes responsables de la enfermedad del mosaico está permitiendo optimizar el manejo de la misma en el marco del PMGCA. -Asimismo, los MM fueron empleados para detectar el hongo Phakopsora pachyrhizi, agente causal de la roya asiática de la soja. La técnica ajustada, de mayor sensibilidad que las utilizadas con anterioridad, permitió confirmar la presencia de este patógeno en las provincias de Catamarca, Tucumán, Santiago del Estero, Salta, Misiones, Corrientes, Santa Fe, Chaco y Entre Rios, y evaluar al mismo tiempo la presencia del hongo Phakopsora meibomiae, también asociado con la enfermedad (García et al., 2005; Ploper et al., 2005). Los MM son la única herramienta disponible para determinar cuál es la especie involucrada, ya que ambos patógenos presentan estructuras morfológicas similares. Como P. meibomiae no provoca daños de tanta magnitud como los de P. pachyrhizi, conocer la identidad patogénica es importante para un manejo adecuado de la enfermedad. -También se caracterizaron morfológica y molecularmente aislamientos de Colletotrichum spp. que integran el complejo fúngico causante de la antracnosis de la frutilla, obtenidos de diversas zonas productoras de Argentina. Los criterios morfológicos resultaron insuficientes para la diferenciación de las tres especies involucradas (C. fragariae, C. gloeosporioides y C. acutatum) e identificaban una especie mayoritaria diferente (C. fragariae) a la que con posterioridad se describió (C. acutatum) con marcadores moleculares. Cabe destacar también, que a partir del análisis de secuencia del ADN ribosomal y de la verificación de los postulados de Koch, se pudo establecer por primera vez un nuevo agente etiológico de la antracnosis de la frutilla: el hongo Acremonium strictum (Racedo et al., 2007). iv) Como se ha intentado ejemplificar en este artículo, son múltiples las aplicaciones de los MM en el área de la biotecnología vegetal y los mismos ofrecen ventajas sobre los marcadores morfológicos, cuya determinación puede estar influenciada por el ambiente y por el estadio fisiológico de la planta o del patógeno y/o microorganismo con el cual interacciona. Sin embargo, los marcadores morfológicos son a veces más fáciles de obtener, más económicos y constituyen una medida más directa del fenotipo, por lo que siguen siendo de gran utilidad y aplicación. Con el ánimo de hacer un estudio comparativo y de complementariedad entre ambos tipos de caracteres, usamos conjuntamente MM y los morfológicos propuestos por la UPOV (Unión Internacional para la Protección de las Obtenciones Vegetales), para caracterizar germoplasma de frutilla y caña de azúcar. En ambos cultivos se observaron diferencias en los agrupamientos de los genotipos obtenidos con los dos tipos de datos, dado que evidentemente los marcadores moleculares examinan regiones del ADN genómico que no se están expresando en los caracteres morfológicos considerados (García et al., 2002; Perera et al., 2009). Con los MM se puede diferenciar genotipos muy emparentados en los que el empleo de marcadores morfológicos puede conducir a una identificación errónea o a la no distinción de los mismos. A partir de los resultados de estos estudios, sugerimos que los MM sean incluidos entre los caracteres propuestos por la UPOV dado que completan la caracterización, permiten monitorear varias regiones del genoma al mismo tiempo y son útiles para inferir relaciones de parentesco. Cabe resaltar que la utilización conjunta de ambos tipos de caracteres permite lograr una caracterización integral y una mejor estimación de la diversidad del cultivo, patógeno u organismo bajo estudio. Un tipo de marcador morfológico con un valor diagnóstico, son los caracteres anatómicos, es decir el análisis de la estructura, forma y composición de las células en los tejidos vegetales. Esta clase de caracteres en forma conjunta con el cariotipo o las características citogenéticas, fueron utilizadas en nuestro laboratorio para identificar y describir una nueva especie vegetal relacionada con la frutilla cultivada: Potentilla tucumanensis Castagnaro & Arias (Castagnaro et al., 1998). En un trabajo posterior, usando marcadores anatómicos y moleculares, fuimos capaces de brindar caracteres diagnósticos para diferenciar especies emparentadas y simpátricas de los géneros Fragaria, Potentilla y Duchesnea (Ontivero et al., 2000). Caracteres morfológicos de tipo anatómico fueron los que utilizamos para identificar, a partir de restos vegetales del calzado de las víctimas del Doble Crimen de la Dársena (Tribunal Oral Federal de Santiago del Estero, TOF; Expediente: 55702/2004), el lugar donde habían estado antes del asesinato. Este constituyó el elemento probatorio principal usado por el TOF para sentenciar la culpabilidad de los imputados. En los instantes en que dos de nuestros científicos hacían su declaración testimonial por separado como Peritos de la Justicia (enero de 2008), el método científico verificaba una vez más cómo la Ciencia es una sola, sin diferenciación entre ?blandas? y ?duras? o sociales y naturales. La Ciencia que habíamos abrazado casi desde adolescentes, nos hacía experimentar nuevas sensaciones y la Justicia, nos rescataba de un abismo de temores, inseguridades, insatisfacciones, y nos proyectaba hacia lo sublime de devolver a la sociedad, de una manera distinta a la acostumbrada, lo que ella había hecho por nosotros. Bibliografía Castagnaro, A.; Diaz Ricci, J.; Arias, M. and Albornoz, P. 1998. A new Southern Hemisphere species of Potentilla (Rosaceae). Novon. 8: 333-336. Filippone, M P.; Noguera, A.; Salgado, M.; Viruel, E.; Perera, M.F.; Ramallo, J. y Castagnaro, A.P. 2006. Sugarcane Systemic Diseases Diagnosis at Estación Experimental Agroindustrial Obispo Colombres (EEAOC). Biocell, 30 (1), pág 212. Abstract 187. Fogliata, G.M.; Canton, N.V.; Muñoz, M.L.; Ploper, L.D.; Farias, M.E.; Vellice, G.R; Salgado, M.; Ontivero M. y Castagnaro A.P. 2004. Síntomas de "moteado" en frutos y hojas de limonero en Tucumán causados por Guignardia mangiferae. Revista Avance Agroindustrial 25(3): 21-26. Fontana, F.; García, G.; Cuenya, M.I.; Chavanne, E.; Ontivero, M.; Diaz Ricci, J.D. y Castagnaro A.P. 2003. Utilidad de la técnica de RAPD de alta resolución para la caracterización de dos genotipos emparentados de caña de azúcar (Saccharum spp). Avance Agroindustrial. 24 (3): 25-26. García, M.G.; Frigidi, V.; Gonzáles, V.; Ploper, L.D. y Castagnaro, A.P. 2005. Monitoreo de Phakopsora pachyrhizi en Argentina. XIII Congreso Latinoamericano de Fitopatología. III Taller de la Asociación Argentina de Fitopatologos. Córdoba, Argentina. García, M.G.; Ontivero, M.; Díaz Ricci, J.C. and Castagnaro A.P 2002. Morphological traits and high resolution RAPD markers for the identification of the main strawberry varieties cultivated in Argentina. Plant Breeding. 12 (1):76-80. Paz, N. del V.; Díaz, M.E.; Noguera, A.S.; Perera, M.F.; Sepúlveda Tusek, M.; Filippone, M.P. y Castagnaro, A.P. 2008. Producción de vitroplantas de caña de azúcar en la Estación Experimental Agroindustrial Obispo Colombres. XV Reunión Técnica Nacional de la Caña de Azúcar. Sociedad Rural de Tucumán. Tucumán, Argentina. Perera, M.F.; Arias, M.E.; Costilla, D.; Luque, C.; García, M.B.; Cuenya, M.I.; Filippone, M.P. y Castagnaro, A.P. 2009. Descripción morfológica y molecular de genotipos de caña de azúcar. RedBio 2009. Rosario, Santa Fe. Perera, M.F.; García, M.B.; Díaz Romero, C; Cuenya, M.I. y Castagnaro, A.P. 2010. Generación de diversidad genética en caña de azúcar: validación molecular de la efectividad de un tratamiento de emasculación. XVI Reunión Técnica Nacional de la Caña de Azúcar. Sociedad Rural de Tucumán. Tucumán, Argentina. Perera, M.F.; Filippone, M.P.; Ramallo, J.; Cuenya, M.I.; García. M.L.; Ploper, L.D. and Castagnaro, A.P. 2009. Genetic diversity among viruses associated with sugarcane mosaic disease in Tucumán, Argentina. Phytopathology, 99(1):38-49. 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Ploper, L.D.; González, V.; Gálvez, M.R.; de Ramallo N.V.; Zamorano M.A.; García G. and Castagnaro, A.P. 2005. Detection of Soybean Rust caused by Phakopsora pachyrhizi in Northwestern Argentina. Plant Disease, 89:774. Rocha, P., García, M.G.; Ledesma, F.; Devani, M. y Castagnaro, A.P. 2007. Molecular identification of advanced lines and genetic diversity in eeaoc soybean genetic improvement program. Biocell. Vol 31 Nº2: 284. Abstracts 138. Sepúlveda Tusek, M.; Perera, M.F.; García, M.G.; Noguera, A.S.; Filippone, M.P. and Castagnaro, A.P. 2008. Optimization of marker techniques to estimate somaclonal variation in in vitro propagated sugarcane. ISSCT IX Plant Pathology and VI Molecular Biology Workshop. Cali, Colombia. Siciliano, F.; Enrique R.; Bermejo C.; Ramallo J.; Ploper D.; Vojnov A.; Castagnaro, A..P. y Marano, M.R. 2006. Desarrollo de un método de diagnóstico molecular para la detección específica de Xanthomonas citri, patógeno causante de la cancrosis de los cítricos. VII Feria Congreso Latinoamericano de Biotecnología ? III Congreso Argentino de Biotecnología (BIOLATINA). Buenos Aires.