Purificación y caracterización de peroxidasa de rábano picante expresada en larvas de Spodoptera Frugiperda

A. M. TARGOVNIK; L. V. ROMERO; F. J. WOLMAN; O. CASCONE; M. V. MIRANDA

Ciudad Autónoma de Buenos Aires

Jornada; Jornada 2009 Academia Nacional de Farmacia y Bioquímica. Herramientas modernas para el estudio de aspectos estructurales de proteínas; 2009

Academia Nacional de Farmacia y Bioquímica

La peroxidasa de rábano picante es útil en muchos campos de la biotecnología tales como diagnóstico, biocatálisis, y biosensores. Se estudiaron distintas estrategias de purificación para la enzima recombinante (rHRP) obtenida por expresión en larvas de Spodoptera frugiperda, directamente a partir del extracto total de larvas. El cDNA conteniendo 2 etiquetas (6xHis y 6xArg) fue clonado bajo el promotor de poliedrina y la secuencia del péptido señal GP67.Las larvas fueron inyectadas con 50 ul de solución stock de baculovirus recombinante (1,4 x 107 ufp/ml) y el nivel de expresión de rHRP fue de 137 +/- 17 mg HRP/Kg de larvas al día 6 post-inyección, equivalente a 41 ug/larva. El extracto total de larvas fue directamente sembrado en una columna de SP-Sepharose y la enzima fue purificada en un solo paso con un rendimiento de 75% y un factor de purificación de 117. por otro lado, la enzima fue también purificada por IMAC en una columna de Ni-Sepharose con un rendimiento de 86% y un factor de purificación de 29. Ambos métodos de purificación producen HRP libre de virus. el pattern de glocosilación concuerda con el esperado para invertebrados. El Km aparente fue de 12,1 +/- 1,7 mM y la Vmáx de 2673 +/- 107 U/mg, similar a la enzima obtenida por extracción de raíces de Amoracia rusticana.El proceso descripto permite obtener altos niveles de HRP activa