INVESTIGADORES
WOLMAN Federico Javier
congresos y reuniones científicas
Título:
Estrategias de purificación para la recuperación de peroxidasa recombinante a partir de larvas de lepidópterosir
Autor/es:
ALEXANDRA M. TARGOVNIK,; LUCÍA V. ROMERO; FEDERICO J. WOLMAN; OSVALDO CASCONE; MARÍA V. MIRANDA
Lugar:
Buenos Aires
Reunión:
Congreso; XII Congreso Argentino de Farmacia y Bioquímica Industrial, X JorFyBi; 2009
Institución organizadora:
SAFYBI
Resumen:
Introducción y objetivo: La expresión de proteínas recombinantes en larvas de lepidópterosinfectadas con baculovirus es altamente eficiente considerando la relaciónrendimiento/costo del proceso. Las larvas de Rachiplusia nu y Spodoptera frugiperda sonplagas agrícolas ampliamente distribuidas en regiones tropicales y subtropicales deAmérica. La utilización de estas larvas como biofábricas resulta una interesante alternativaa los cultivos celulares de células de insectos para su aplicación en procesosbiotecnológicos destinados a la producción de enzimas de interés comercial. Para que laecuación económica sea completa, el proceso de producción de proteínas basado en larvasde insectos debe estar acoplado a un método efectivo y económico de Downstreamprocessing.La isoenzima C de peroxidasa de Armoracia rusticana (HRPC) es una enzima que tienemúltiples aplicaciones en la producción de anticuerpos marcados, el tratamiento deefluentes, la fabricación de biosensores, etc. El objetivo de este trabajo fue optimizar ycomparar los niveles de recuperación y pureza de la HRP recombinante expresada en larvasde R. nu y S. frugiperda por cromatografía de intercambio ionico (IEC) y cromatografía deiones metálicos inmovilizados (IMAC).Materiales y Métodos: Se construyó un baculovirus recombinante (vAcHRP) quepresentaba el cDNA del gen HRPC, flanqueado por dos etiquetas, una de 6 residuos dehistidinas en el extremo amino y otra de 6 argininas en el extremo carboxilo. Larvas de R.nu y S. frugiperda del 5º estadio se infectaron con el baculovirus recombinante. Para lainoculación, las larvas se anestesiaron por inmersión en un baño de agua helada durante 10min y se les inyectó 50 μl de suspensión viral de alto título (≅107 pfu/ml) vía subcutánea.Una vez infectadas, las larvas se llevaron al cuarto de cría (25ºC) y se alimentaron con unadieta artificial a base de germen de trigo. Se prepararon homogenatos de larvas al 4to díapostinfección en el caso de R. nu y al 6to día postinfección en el caso de S. frugiperda enbuffer de fosfatos de sodio 0,05 M, pH 6, EDTA 5 mM, KCl 0,15 M con agregado decristales de glutatión. Los extractos se clarificaron por centrifugación (10000xg, 10 min).Posteriormente se preacondicionaron las muestras en una columna de exclusión molecularpD10 en buffer de fosfatos de sodio 25 mM, pH 8, NaCl 300 mM y se sembraron en unamatriz de IMAC utilizando níquel como ligando (HisTrapFF, 1 ml). Se trabajó a un flujode 0,4 cm min -1 y se eluyó la enzima por agregado de imidazol 250 mM.Por otra parte, se realizaron los respectivos homogenatos en buffer Tris-HCl 0,05 mM pH 7(buffer de equilibración de IEC) al cual se le agregó cristales de glutatión. Las muestras seclarificaron por centrifugación (10000xg, 10 min) y se sembraron directamente encolumnas de intercambio de cationes (SP-HiTrapFF, 1 ml). Se trabajó a un flujo de 0,4 cmmin -1 y la elución se llevó a cabo por etapas utilizando diferentes concentraciones de NaCl(25, 150, 500 mM y 30, 80 y 500 mM para la purificación a partir de extracto de S.frugiperda y R. nu respectivamente) en el buffer de equilibración. El seguimiento de lascromatografías se realizó por absorbancia en 280 nm y por actividad enzimática utilizandoun método cinético empleando guayacol como sustrato. El producto purificado se analizópor SDS-PAGE y Western Blot. Además se determinaron los parámetros cinéticos (Km yVmáx).Resultados: La concentración de HRP recombinante expresada en larvas S. frugiperda fuede 137±17 mg/Kg de larva. Se purificó por IMAC con un índice de purificación (IP) de29,23 y un rendimiento del 86%, mientras que por IEC el IP alcanzado fue de 117 y elrendimiento del 75% (150 mM NaCl). Por otra parte, la concentración de HRPrecombinante en larvas de R. nu fue de 110 ± 10 mg/Kg larva. Se logró purificar por IMACcon un IP de 13,2 y un rendimiento del 89,2%. Por IEC se obtuvo un IP de 166 con unarecuperación de 74% (80 mM NaCl).La Km y Vmáx de la HRP recombinante expresada en S. frugiperda fue de 12.1 ± 1.7 mM y2673 ± 113 U mg-1 respectivamente. Mientras que en el caso de la HRP expresada en R. nuel valor obtenido de Km fue 17,3 ± 2 mM y el de Vmáx fue de 2778,4 ± 116,4 U mg-1. Enambos casos, los valores fueron similares a los correspondientes a la HRP estándar deorigen vegetal (Km: 18,8 ± 2,2 mM y Vmáx: 3102,3 ± 67,8 U mg-1).Conclusión: El nivel de expresión de HRP recombinante fue superior en S. frugiperdacomparado con R. nu. La enzima demostró ser en ambos casos similar a la HRP estándar encuanto a sus propiedades cinéticas. Si bien, ambas estrategias cromatográficas resultaronefectivas, en el caso de la purificación por IEC, no fue necesario preacondicionar elextracto. Por otra parte, el costo de downstream processing se reduce considerablementecuando se utilizan matrices de intercambio iónico en comparación con las depseudoafinidad. Purificando la HRP recombinante en IEC se logró en un solo paso altosrendimientos (cercanos al 80%) y un producto de elevada pureza (IP 141) adecuado paralas aplicaciones como biocatalizador.