Purificación de lactoferrina a partir de suero y calostro por cromatografía de pseudobioafinidad sobre soportes convectivos

F. J. WOLMAN; D. G. MAGLIO; M. GRASSELLI; O. CASCONE

Ciudad Autónoma de Buenos Aires

Congreso; X Congreso Argentino de Farmacia y Bioquímica Industrial; 2005

Asociación Argentina de Farmacia y Bioquímica Industrial

Introducción Los sistemas de membranas adsortivas fueron propuestos como una nueva tecnología para la recuperación y purificación de bioproductos. En éstos las moléculas son transportadas convectivamente hacia el ligando inmovilizado sobre la superficie porosa, reduciéndose drásticamente la resistencia al transporte de masa en la matriz cromatográfica y resultando en procesos adsortivos rápidos. La no  necesidad de una extensa clarificación de la muestra, redunda en el carácter integrativo y de alta productividad de los sistemas de membranas. Por otro lado, los colorantes triazínicos son de elección por su bajo costo, amplia diponibilidad, alta estabilidad tanto química como térmica respecto de ligandos peptídicos, sencilla inmovilización sobre la matriz y aceptable capacidad y selectividad hacia proteínas. Debido al interés que reviste la lactoferrina bovina por su uso como preparado nutracéutico, se seleccionó esta proteína para el presente trabajo. La lactoferrina es un potente bactericida de amplio espectro debido fundamentalmente a su acción quelante sobre el metal hierro. Como fuente de lactoferrina se estudian calostro bovino y suero bovino de queso, siendo este último un material de desecho industrial. Materiales y Métodos    Las membranas de fibra hueca fueron epoxiactivadas por tratamiento con radiación gamma en presencia de una mezcla de glicidlmetacrilato (GMA) y dimetilacrilamida (DMAA). Los grupos epóxido fueron abiertos por reacción con amoníaco y finalmente el colorante Red HE-3B fue inmovilizado por reacción con los grupos amino de las fibras. Las isotermas de adsorción se obtuvieron enfrentando 50 ml de matriz con cantidades crecientes de solución estándar de lactoferrina (0,125 a 5 mg/ml). Los parámetros constante de disociación  y capacidad máxima se determinaron por ajuste a la ecuación de Langmuir. Todas las concentraciones de lactoferrina fueron determinadas por ELISA (Bethyl Laboratories Inc., USA) Para los estudios dinámicos las membranas derivatizadas se ensamblaron en un cartucho cromatográfico, resultando en un volumen total de matriz de 1 ml. Para los procesos de purificación a partir de suero se sintetizó y empaquetó en una columna cromatográfica 1 ml de Sepharose 4 B-Red HE-3B siguiendo un protocolo estándar. Los estudios con suero fueron realizados sobre ambos soportes en diferentes condiciones de flujo (0,4 ml/min, 1,0 ml/min y 5,0 ml/min). Resultados y Discusión Los sistemas de membranas de fibra hueca mostraron en condiciones de equilibrio una mejor performance respecto de los sistemas difusivos de geles blandos, con una Qm de 110 mg/ml de matriz contra una Qm de 9,29 mg/ml para la Sepharose-Red HE-3B. Los estudios dinámicos a partir de suero permitieron recuperar el 90 % de la lactoferrina presente en éste, con una productividad hasta un 500 % mayor para los sistemas de membranas respecto de los de geles blandos. Conclusiones Se lograron sintetizar membranas con Red HE-3B inmovilizado con una capacidad de adsorción para lactoferrina bovina mayor respecto de la obtenida con sistemas tradicionales de geles blandos y cuya performance en condiciones dinámicas es mayor a la de éstos en hasta un 500 % en términos de productividad (cantidad de proteína purificada/tiempo).