INVESTIGADORES
WOLMAN Federico Javier
congresos y reuniones científicas
Título:
PURIFICACIÓN DE LACTOFERRINA BOVINA UTILIZANDO COLORANTES TEXTILES
Autor/es:
MARÍA FERNANDA BAIELI; NICOLÁS URTASUN; MARÍA VICTORIA MIRANDA; OSVALDO CASCONE; FEDERICO JAVIER WOLMAN
Lugar:
CABA
Reunión:
Congreso; ETIF 2014. 8º CONGRESO Y EXPOSICIÓN PARA LA CIENCIA Y TECNOLOGÍA FARMACÉUTICA, BIOTECNOLÓGICA Y VETERINARIA; 2014
Institución organizadora:
ETIF
Resumen:
En el presente trabajo se propuso un nuevo ligando de afinidad de bajo costo para la recuperación y purificación de lactoferrina bovina (Lf) y así contribuir al desarrollo industrial. La lactoferrina (Lf) es una glicoproteína que está presente en secreciones externas de mamíferos y es moduladora del metabolismo del hierro, promotora de la flora intestinal, actúa como factor de crecimiento y maduración de células intestinales y es anticancerígena, antimicrobiana, antiviral y antioxidante. Desde el punto de vista industrial, la utilización de colorantes triazínicos como ligandos resulta atractiva por su beneficiosa relación costo/selectividad. Este tipo de ligandos se caracteriza por su bajo costo y su alta estabilidad química, térmica y mecánica. Entre los colorantes triazínicos para la purificación de Lf se probaron el Red HE-3B y el Yellow HE-4R. El objetivo fue inmovilizar ambos colorantes sobre Sepharose 4B para testear la purificación de Lf. Metodología Síntesis de las matrices. Los colorantes Red HE-3B y Yellow HE-4R fueron inmovilizados sobre Sepharose 4B. Estas matrices se denominan S-R y S-Y, respectivamente. Isotermas de adsorción. Se realizaron a pH 7,0, enfrentando concentraciones crecientes de solución de Lf pura (0,063 a 10 mg/ml) con 50 mg de las matrices S-R y S-Y. El buffer utilizado fue buffer de fosfatos 20 mM, pH 7,0. La concentración de Lf en las soluciones se midió por absorbancia en 280 nm y la cantidad de proteína adsorbida a la matriz se calculó como la diferencia de concentración de Lf en el sobrenadante antes y después del proceso adsortivo. Estudio de elución. 50 mg de las matrices S-R y S-Y, previamente saturadas con Lf, se incubaron por 10 h diferentes soluciones de elución. Diez soluciones de elución fueron probadas. Proceso de purificación. El proceso adsortivo se realizó en modo batch enfrentando 1 ml del suero de queso clarificado con 25 mg de cada matriz. Luego de tres lavados con buffer de fosfatos 20 mM con 0,5 M de NaCl, pH 7,0, se eluyó la proteína adsorbida con 0,5 ml del eluyente. Las matrices se reutilizaron en otros 2 ciclos consecutivos sin tratamiento de regeneración. El seguimiento de los procesos fue monitorizado por un ELISA comercial y SDS-PAGE 15%, y las proteínas totales se determinaron por el método de Bradford. Resultados Para caracterizar termodinámicamente las matrices, se realizaron las isotermas de adsorción, observándose que los valores de Kd obtenidos (0,1 mg/ml) fueron en el mismo orden de magnitud que la concentración de Lf en el suero de queso (0,08-0,1 mg/ml), lo que indica que estos ligandos aseguran una eficiente adsorción de Lf del suero de queso. Las capacidades máximas de adsorción para Lf obtenidas a pH 7,0 utilizando las matrices S-Y y S-R fueron de 40,2 y 27,8 mg/g, respectivamente. Al evaluar la eficiencia de los eluyentes testeados, se pudo observar que 25% etilenglicol con 0,5 M de NaSCN y 25% etilenglicol con 2 M de NaCl, a pH 7,0 o 9,0, fueron los mejores eluyentes para la desorción de Lf con porcentajes de elución mayores al 71%. La matriz S-Y fue la que mostró una mejor performance del proceso de purificación a partir del suero de queso, con una adsorción del 98% de la Lf, una elución del 65% de la proteína adsorbida, un factor de purificación de 33 y un rendimiento del proceso del 63%. Durante los tres procesos de purificación, las matrices mostraron valores de adsorción similares, mientras que los valores de elución aumentaron ligeramente en el tercer ciclo. La pureza del producto obtenido en un único paso, determinada por SDS-PAGE, fue de 95 y 92% para las matrices S-Y y S-R, respectivamente. Conclusiones Los procesos de purificación utilizando la matriz con el colorante Yellow HE-4R mostraron un mejor rendimiento que las matrices con el colorante Red HE-3B. La matriz S-Y fue capaz de unir selectivamente la Lf a partir del suero de queso, recuperando la Lf con un alto grado de pureza en un solo paso.