Estudio de la expresión de lactoferricina bovina recombinante en el sistema baculovirus/células de insectos

NICOLÁS URTASUN; OSVALDO CASCONE; FEDERICO J. WOLMAN; MARÍA V. MIRANDA

Buenos Aires

Congreso; X Congreso Argentino de Virología, III Simposio de Virología Clínica y I Simposio de Virología Veterinaria de la Asociación Argentina de Microbiología; 2011

Asociación Argentina de Microbiología

La lactoferricina bovina (LfcnB) es un péptido catiónico de peso molecular 3124 Da que deriva de la fracción Phe17- Phe41 del extremo amino de la lactoferrina bovina y constituye un potente antibacteriano frente a diferentes bacterias, exhibiendo mayor actividad específica que la Lfcn humana, murina o caprina. Además presenta actividad antifúngica, antiviral y antitumoral. La fuente de obtención de LfcnB es por hidrólisis de la lactoferrina bovina por pepsina. Su expresión de manera recombinante en Escherichia coli o Pichia methanolic resulta tóxica para estos microorganismos. El objetivo de este trabajo es estudiar la expresión de LfcnB recombinante en el sistema baculovirus/células de insecto para su posible producción a escala industrial en larvas de lepidópteros. Para ello, a partir del gen de LfcnB en el vector pUC18 se subclonó la secuencia codificante en diferentes plásmidos de transferencia generando las siguientes construcciones: pVL1393-LfcnB, pAcGP67B-LfcnB, pAcG2T-LfcnB y pAcSecG2T-LfcnB. Se obtuvieron cuatro baculovirus recombinantes por cotransfección de cada una de las construcciones mencionadas con el ADN viral BaculoGoldTM Bright (Pharmingen) utilizando la línea celular Sf9 en medio de cultivo Sf900 II suplementado con 1% de suero fetal bovino. En todos los casos, la expresión del gen de LfcnB está dirigida por el promotor de poliedrina viral. Los baculovirus recombinantes se amplificaron hasta lograr stocks de trabajo de alto título, los cuales fueron utilizados para infectar cultivos celulares. Se desarrolló un ELISA competitivo para cuantificar los niveles de expresión de LfcnB para los diferentes baculovirus recombinantes. Cuando se infectaron células Sf9 con el baculovirus que permite su expresión y acumulación en citoplasma (AcMNPV-LfcnB, MOI = 2) se registró el valor máximo de 246 ± 23 µg de LfcnB/L de cultivo (1,5.109 células por litro) al 3er día. Por otra parte, cuando el péptido LfcnB fue liberado al medio de cultivo utilizando el baculovirus AcMNPV-GP67B-LfcnB, el nivel máximo de expresión alcanzado fue de 163 ± 30 µg/L de cultivo (1,5.109 células por litro) al 6to día. Utilizando los baculovirus que expresan LfcnB como proteína de fusión de la enzima glutatión S-transferasa (GST) el máximo nivel de expresión (1,2 ± 0,4 mg de LfcnB/L de cultivo) se registró cuando la proteína se acumula en citoplasma con el baculovirus AcMNPV-G2T-LfcnB, MOI= 2, al 3er día post infección. En conclusión, los niveles de expresión obtenidos con LfcnB fusionada a GST son adecuados para iniciar el proceso de downstream de este péptido. Esta estrategia será utilizada en la infección de diferentes larvas de lepidópteros susceptibles a baculovirus, disminuyendo los costos de producción y realizando posible el desarrollo de una plataforma de producción industrial.