INVESTIGADORES
WOLMAN Federico Javier
congresos y reuniones científicas
Título:
DESARROLLO DE UNA NUEVA PLATAFORMA PARA LA EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE LACTOFERRICINA BOVINA RECOMBINANTE
Autor/es:
NICOLÁS URTASUN; MARÍA F. BAIELI; OSVALDO CASCONE; FEDERICO WOLMAN; MARÍA VICTORIA MIRANDA
Lugar:
La Plata
Reunión:
Simposio; SAProBio 2012. II Simposio Argentino de Procesos Biotecnológicos, Prof. Dr. Rodolfo Ertola; 2012
Institución organizadora:
CINDEFI, UNLP
Resumen:
Introducción La lactoferricina bovina (LfcnB) es un péptido catiónico de peso molecular 3124 Da que deriva de la fracción Phe17- Phe41 de la lactoferrina bovina y constituye un potente antibacteriano. Exhibe mayor actividad específica que la lactoferricina humana, murina o caprina. Además presenta actividad antifúngica, antiviral y antitumoral. La principal fuente de obtención de la LfcnB es por hidrólisis de la lactoferrina bovina con la enzima pepsina. La expresión recombinante de LfcnB en Escherichia coli o Pichia methanolica resulta tóxica para estos microorganismos. El objetivo de este trabajo fue evaluar la expresión de LfcnB recombinante utilizando el sistema baculovirus/células de insecto y realizar la búsqueda de colorantes triazínicos para lograr la purificación por afinidad de la LfcnB utilizando la técnica de resonancia plasmática de superficie. Metodología Expresión: A partir del gen de la LfcnB clonado en el vector pUC18 se subclonó la secuencia codificante en diferentes plásmidos de transferencia generando las siguientes construcciones: pVL1393-LfcnB, pAcGP67B-LfcnB, pAcG2T-LfcnB y pAcSecG2T-LfcnB. Se obtuvieron cuatro baculovirus recombinantes por cotransfección de cada una de las construcciones mencionadas con el ADN viral BaculoGoldTM Bright (Pharmingen) utilizando la línea celular Sf9 en medio de cultivo Sf900 II suplementado con 1% de suero fetal bovino. En todos los casos, la expresión del gen de la LfcnB está dirigida por el promotor de poliedrina viral. Los baculovirus recombinantes se amplificaron hasta lograr stocks de trabajo de alto título, los cuales fueron utilizados para infectar cultivos celulares. Cuantificación: Se desarrolló un ELISA competitivo para cuantificar los niveles de expresión. En el caso de los baculovirus que expresan la LfcnB como proteína de fusión con la enzima glutatión S-transferasa (GST) se cuantificaron los niveles de expresión por actividad enzimática de GST por conversión del sustrato 1-cloro-2,4-dinitrobenceno (CNDB) en 340 nm y en presencia de glutation. Este método de cuantificación también se empleó para la evaluación de los procesos de purificación. Secreening de colorantes: Utilizando el equipo de resonancia plasmática de superficie Biacore (GE) se inmovilizó LfcnB sintética (GenScript) y se determinó la afinidad por distintos colorantes triazínicos que se utilizaron como analitos. Se emplearon los colorantes Yellow HE-4R, Red HE-3B, Reactive Green 19, Cibacron 3GA y Red F5B. Purificación: La LfcnB como proteína de fusión a GST presente en sobrenadantes de cultivos o lisados de pellet celulares se purificó con las matrices cromatográficas Yellow Sepharose y Red Sepharose. Con el objetivo de incrementar la selectividad del proceso cromatográfico, se estudió el efecto de la fuerza iónica adicionando distintas concentraciones de NaCl a la muestra a procesar. Los ensayos de adsorción se realizaron en batch a 4°C overnight y los siguientes pasos de lavados y elución a temperatura ambiente. Resultados Cuando se infectaron células Sf9 con el baculovirus para la expresión y acumulación de la LfcnB en citoplasma (AcMNPV-LfcnB, MOI = 2) se registró el valor máximo de 246 ± 23 µg de LfcnB/L de cultivo (1,5.109 células por litro) al 3er día. Por otra parte, cuando la LfcnB fue secretada al medio de cultivo utilizando el baculovirus AcMNPV-GP67B-LfcnB, el nivel máximo de expresión alcanzado fue de 163 ± 30 µg/L de cultivo (1,5.109 células por litro) al 6to día. Utilizando los baculovirus que expresan la LfcnB como proteína de fusión de la enzima GST se registró el máximo nivel de expresión (3,3 ± 0,7 mg/L en cultivos en suspensión cuando la proteína se acumuló en citoplasma con el baculovirus AcMNPV-G2T-LfcnB, MOI= 0,5 al 2do día post infección. Por screening de colorantes triazínicos utilizando resonancia plasmática de superficie (Biacore, GE) se seleccionaron los colorantes Yellow HE-4R y Red HE-3B como posibles candidatos. El colorante Yellow HE-4R presentó una Kd = 1,1 ± 0,3 x 10-7 y el colorante Red HE-3B una Kd = 1,6 ± 0,4 x 10-5, siendo los dos que mostraron mayor afinidad por la LfcnB. Estos resultados correlacionaron con la adsorción en batch de LfcnB en las matrices cromatográficas Yellow Sepharose y Red Sepharose. Conclusiones: Los niveles de expresión máximos fueron obtenidos cuando se expresó la LfcnB fusionada a GST. El producto recombinante no resultó ser tóxico para el huésped. Este baculovirus recombinante es adecuado para la infección de larvas de lepidópteros con el fin de desarrollar una plataforma viable y de bajo costo para escalar la producción del péptido. Asimismo el empleo de colorantes triazínicos mostro una adecuada performance en los procesos de purificación planteados. El uso de estos colorantes como ligandos presenta ventajas como su bajo costo, amplia disponibilidad, simple inmovilización, elevada resistencia a la degradación biológica y mecánica, elevada capacidad de adsorción de proteínas y razonable selectividad. Esto posibilitaría a futuro, plantear procesos de purificación empleando estos colorantes en combinación con otros sistemas de bajo costo como los de partición en dos fases acuosas.