INVESTIGADORES
WOLMAN Federico Javier
congresos y reuniones científicas
Título:
PURIFICACIÓN DE AGLUTININA DE GERMEN DE TRIGO MEDIANTE CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD
Autor/es:
MARÍA F. BAIELI; OSVALDO CASCONE; FEDERICO J. WOLMAN
Lugar:
La Plata
Reunión:
Simposio; SAProBio 2012. II Simposio Argentino de Procesos Biotecnológicos, Prof. Dr. Rodolfo Ertola; 2012
Institución organizadora:
CINDEFI, UNLP
Resumen:
Introducción Las lectinas son proteínas no inmunogénicas presentes en plantas y animales. Interaccionan de manera selectiva con hidratos de carbono libres o asociados a proteínas y tienen la capacidad de aglutinar eritrocitos. La aglutinina de germen de trigo (WGA) es una lectina de aproximadamente 35 kDa constituída por dos subunidades idénticas de 17 kDa, pudiendo hallarse en forma disociada a pHs ácidos. Tiene reconocimiento específico por ácido N-acetil neuramínico y por N-acetil glucosamina. Al ser una proteína estructuralmente compleja con elevado contenido de cisteína, su expresión por técnicas recombinantes es dificultosa. Por consiguiente, las metodologías extractivas a partir del germen de trigo siguen siendo las estrategias dominantes para su obtención. La WGA es una proteína de alto valor agregado y con un mercado creciente debido a sus múltiples usos para la purificación y el estudio de glicoconjugados. El quitosano es un polímero lineal compuesto por unidades de N-acetil glucosamina y glucosamina que se obtiene por desacetilación parcial de la quitina, siendo la quitina el principal constituyente del exoesqueleto de insectos y crustáceos. Debido a la presencia de grupos amino primarios libres, el quitosano es hidrosoluble en condiciones de pH ácido mientras que es insoluble en pHs alcalinos. Se trata de un polímero de bajo costo, abundantemente distribuído en la naturaleza y de fácil obtención, es biodegradable, biocompatible y ambientalmente seguro. Por estas propiedades resulta interesante su utilización como material cromatográfico. Uno de los desafíos del downstream processing es la posibilidad de contar con matrices que posibiliten purificar bioproductos a partir de muestras complejas en pocas etapas y con bajo costo. En este sentido, en el presente trabajo se sintetizaron mini esferas de quitosano -cuya resistencia mecánica fue incrementada por entrecruzamiento con epiclorhidrina-, con el objeto de purificar en una única etapa la WGA a partir de extractos de germen de trigo. Materiales y Métodos Síntesis de las miniesferas. Se obtuvieron por goteo de una solución de quitosano al 2 % en ácido acético al 2 % sobre NaOH 2 M. Las mini esferas fueron entrecruzadas por reacción con soluciones de epiclorhidrina (0,045 a 0,50 M) pH 10, 60º C, 4 h. Se generaron 3 matrices de acuerdo a la concentración del entrecruzante utilizado: CH45, CH250 y CH500 correspondientes a 45, 250 y 500 mM de epiclorhidrina, respectivamente. Los estudios se realizaron también sobre una matriz comercial a base de quitina (CHC, de New England Biolabs) Isotermas de adsorción. Se realizaron a pH 5,0 y 8,5, enfrentando concentraciones crecientes de solución de WGA pura (0,008 a 1 mg/mL) en un volumen de 5 mL con 25 mg de las distintas matrices sintetizadas, durante 10 h a temperatura ambiente. Los buffers utilizados fueron buffer de acetatos 20 mM, pH 5,0 + 150 mM NaCl y buffer Tris/HCl 20 mM, pH 8,5 + 150 mM NaCl. La cantidad de proteína adsorbida a la matriz se midió por absorbancia en 277 nm y se calculó como la diferencia de concentración de WGA en el sobrenadante antes y después del proceso adsortivo. Obtención del extracto de germen de trigo. 500 g de germen fueron deslipidizados por tratamiento con 3 L de n-hexano durante 3 h a temperatura ambiente. El germen desgrasado fue secado y sometido a tratamiento con 4 L de HCl 50 mM para la extracción de WGA. El pH del extracto fue ajustado a 7,0 y concentrado 10 veces por ultrafiltración tangencial utilizando cartuchos de fibra hueca con cut off de 10 kDa. El extracto concentrado fue diafiltrado con 5 volúmenes de buffer Tris 20 mM, pH 8,5 + NaCl 0,15 M. Proceso de Purificación. El proceso adsortivo se realizó en modo batch enfrentando 5 mL del extracto de germen concentrado con 500 mg de cada matriz durante 10 h a temperatura ambiente y con agitación suave. Luego de tres lavados con buffer Tris pH 8,5, se eluyó la proteína adsorbida por tratamiento con 3 mL de ácido acético 1 M. Las matrices se reutilizaron en 2 ciclos consecutivos sin previo tratamiento de regeneración. El seguimiento de los procesos fue por actividad aglutinante sobre eritrocitos humanos (A+) y RP-HPLC, y las proteínas totales se determinaron mediante el método de Bradford. Resultados Todas las mini esferas sintetizadas mostraron un tamaño similar de 2,0 mm. Mediante microscopía electrónica de barrido se comprobó la homogeneidad de las matrices sintetizadas, la ausencia de aglomeraciones y la porosidad de sus estructuras. Las capacidades máximas de adsorción para WGA obtenidas a pH 5,0 fueron de 48, 43 y 49 mg/g y a pH 8,5 fueron de 28, 19 y 17 mg/g para las matrices CH45, CH250 y CH500, respectivamente. Las capacidades máximas de adsorción para la matriz CHC fueron de 20 y 14 mg/g a pH 5,0 y 8,5 respectivamente. Resulta interesante destacar el impacto del pH en la capacidad máxima de adsorción en todos los casos. Asimismo, todas las matrices desarrolladas en el presente trabajo superaron a la matriz comercial respecto de la capacidad máxima de adsorción de WGA. A pesar de la mayor capacidad de adsorción para la lectina a pH 5,0, la performance de los procesos de purificación resultó más eficiente a pH 8,5, cercano al pI de la WGA. De las matrices sintetizadas la matriz CH250 fue la que mostró una mejor performance del proceso de purificación, con una adsorción del 95% de la WGA, una elución del 100% de la proteína adsorbida, un factor de purificación de 57 y un rendimiento del proceso del 95%. Para la matriz CHC la adsorción fue del 93%, la elución del 63%, el factor de purificación de 41 y el rendimiento global del 58%. En todos los casos la pureza del producto obtenido, determinada por RP-HPLC fue mayor al 95% . Con el objeto de evaluar la estabilidad y resistencia de la matriz CH250, se la sometió a dos ciclos consecutivos de purificación a partir del extracto concentrado de WGA, resultando en una adsorción del 90 y del 80% con eluciones del 100 y 90% para los ciclos 1 y 2, respectivamente. En todos los casos la pureza obtenida fue mayor al 95%. Conclusiones Se logró desarrollar una matriz de afinidad por WGA que permitió su purificación en una única etapa a partir de un extracto concentrado de germen de trigo. Dicha matriz resultó ser de bajo costo y elevada estabilidad mecánica. La performace de la matriz superó a la matriz comercial tanto en los estudios adsortivos utilizando la proteína pura como en los procesos de purificación a partir del extracto. Los perfiles cromatográficos del producto obtenido muestran un grado de pureza mayor al 95%.