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DESARROLLO DE UNA VACUNA A SUBUNIDAD CONTRA EL VIRUS DE LA DIARREA VIRAL BOVINA UTILIZANDO PLANTAS DE ALFALFA TRANSGÉNICAS MS Pérez Aguirreburualde1; , A. Ostachuk1, A Pécora1; F.J. Wolman2, A Samarruco1,C Gomez3 F Ardila3, M.J. Dus Santos1, A. Wigdorovitz 1 1Instituto de Virología, CICVyA, INTA-Castelar, Buenos Aires, Argentina. 2Cát. Microbiología Industrial & Biotecnología, FFYB, UBA 3Instituto de Genética, CNIA, INTA-Castelar, Buenos Aires, Argentina. La utilización de vacunas convencionales para el virus de la diarrea viral bovina (VDVB) presenta ciertas limitaciones por lo que actualmente se está investigando el uso de vacunas a subunidad como una estrategia alternativa. La glicoproteínas E2, contiene los principales sitios antigénicos para la producción de anticuerpos neutralizantes (AN), los que juegan un papel preponderante en el fenómeno de protección frente a la infección. La utilización de plantas transgénicas para la expresión de proteínas heterólogas con fines terapéuticos o para su utilización como vacunas ha sido ampliamente reportada. Sin embargo, una limitación importante del sistema, ha sido hasta el momento la baja concentración de las proteínas recombinantes en los tejidos de las plantas. Debido al bajo costo, facilidad de escalado y altos rendimientos de recuperación, este proyecto propone la utilización y puesta a punto de un sistema de partición de dos fases para la concentración de la proteína E2T (fracción soluble de la E2) expresada de forma constitutiva en alfalfa transgénica y la evaluación de dicho antígeno en una vacuna experimental. En trabajos previos hemos descrito la producción de las plantas de alfalfa transgénicas que expresan la proteína E2T así como la caracterización de las mismas. En este trabajo se utilizaron dos metodologías para concentrar la proteína E2T columnas de filtración (centricon plus 70 amicon) y sistema de dos fases acuosas (PEG 4000/buffer de fosfatos pH 7) Con ambos sistemas se logró incrementar hasta 5 veces la concentración de la proteína E2T. Es importante destacar que para el caso de dos fases la eficiencia del proceso fue aumentando con el incremento en la escala de trabajo. A partir de los antígenos producidos se formularon las vacunas experimentales conteniendo la proteína E2T proveniente de las plantas de alfalfa transgénicas concentradas por centricon y por el sistema de dos fases, y sus respectivos controles (extractos de plantas normales con iguales procesos y una vacuna a virus completo inactivado). Para este trabajo se utilizaron 18 bovinos libres de VDVB. Se formaron 6 grupos de 3 bovinos cada uno, se inmunizaron intramuscularmente con 3 ml de vacuna. A los 30 días se boostearon y se sangraron a los 60 días post inoculación. Se analizaron los sueros por seroneutralización y ELISA. Para el caso de la las vacunas que contenían la proteína E2T concentrada por el sistema de dos fases los títulos de AC fueron siempre ³2. Mientras que para la vacuna formulada a partir de la concentración con centricon fue necesario una tercera inmunización para alcanzar los mismos niveles de anticuerpos neutralizantes. Estos resultados demuestran, la factibilidad de obtener una vacuna a subunidad producida a partir de alfalfas transgénicas utilizando un único paso de concentración muy sencillo y económico lo que abre la posibilidad de escalado y evaluación de factibilidad de la plataforma propuesta para la formulación de vacunas basadas en la tecnología desarrollada.

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