Estudio de las proteínas de larvas de Rachiplusia nu infectadas con baculovirus recombinante a través de geles 2-DE para el desarrollo racional de procesos de purificación de proteínas recombinantes

ALEXANDRA MARISA TARGOVNIK; MARIANA BERNADETT ARREGUI; MARIELA FOGAR; FEDERICO JAVIER WOLMAN; OSVALDO CASCONE; MARÍA VICTORIA MIRANDA

CABA

Congreso; XI Congreso Argentino de Virología. II Congreso Latinoamericano de Virología; 2015

AAM

La expresión de proteínasrecombinantes en el sistema baculovirus/células de insecto es cada vez másutilizado. Para aquellos productos que no tienen alto valor de mercado, cabe laposibilidad de utilizar directamente los insectos vivos como biofábricas. Lasespecies susceptiblesa baculovirus pertenecen a la familia Noctuidae que corresponden a mariposas dehábitos nocturnos como ser R. nu. El sistema está limitado para suutilización en la producción de proteínas de interés comercial dado el escasoconocimiento sobre el downstream processing de proteínas recombinantes a partirde extractos larvales. Cuando se trata con muestras complejas como en este casoes crítico el diseño de esquemas de purificación que involucren un númeroreducido de etapas y establecer las condiciones óptimas de cada una de ellaspara lograr un alto grado de purificación y rendimiento del producto. Cuando setrata de establecer métodos generales en sistemas no estudiados en profundidad,es necesario describir el proteoma del huésped (proteínas contaminantes delproceso). El objetivo de este trabajo es analizar a través de geles 2-DE, elperfil proteico de extractos larvales no infectados e infectados conbaculovirus recombinante, con el fin de identificar los principalescontaminantes virales y del huésped. Las larvas de R. nu fueron criadasy alimentadas con dietas artificiales hasta alcanzar el 4º estadio donde fueroninfectadas con baculovirus recombínate que expresaba el gen de Interferón Betafelino. Las larvas fueron cosechadas a los 3 días post infección yhomogeneizadas. Los homogenatos fueron centrifugados a 14000 rpm durante 10minutos a 4 °C y filtrados con un papel Whatman grado 1. Las muestras fueronanalizadas a través de geles 2-DE seguido, en el caso que correspondiera, deWestern Blot con anticuerpos específicos anti extracto total de larva. Losgeles fueron analizados a través del software ImageMaster 2D platinum 6.0 (GEHealthcare). A través de geles 2-D se pudo evidenciar una clara diferencia delperfil proteico de la larva infectada respecto de la larva control. Sedetectaron alrededor de 50% menos número de spots en la larva infectadademostrando un proceso de silenciamiento y redireccionamiento de la maquinariade transcripción por parte del virus. Los puntos isoeléctricos de los spots seubicaron alrededor de todo el gradiente de pH (3-10) presentando una mayordensidad de proteínas a pesos moleculares superiores 20 kDa. Mediante WesternBlot con anticuerpos específicos anti larva, se pudo detectar 47 proteínasinmunogénicas en la larva infectada respecto a 69 proteínas inmunogénicas en lalarva control, todas proteínas de tendencia básicas y peso molecular superior a26 kDa. Este conocimiento de las propiedades fisicoquímicas de las proteínasdel huésped de expresión posibilitaría el desarrollo futuro de procesos dedowmstream in silico permitiendo predecir desde un principio el grado decomplejidad del proceso