INVESTIGADORES
WOLMAN Federico Javier
congresos y reuniones científicas
Título:
Nuevo ligando de afinidad para la purificación de lactoferrina bovina
Autor/es:
MARÍA FERNANDA BAIELI; NICOLÁS URTASUN; MARÍA VICTORIA MIRANDA; OSVALDO CASCONE; FEDERICO JAVIER WOLMAN
Lugar:
Santa Fe
Reunión:
Congreso; SaProBio 2014. 3º Simposio Argentino de Procesos Biotecnológicos; 2014
Institución organizadora:
UNL
Resumen:
Introducción Las dos grandes etapas de recuperación y purificación de proteínas se denominan en conjunto downstream processing. Los análisis económicos actuales demuestran que los costos asociados a las etapas de downstream processing representan alrededor del 50-80% del costo total de un proceso productivo. Por lo tanto, una disminución en el número de operaciones unitarias o un aumento en la performance del proceso generarán una disminución en el costo total del producto. En el presente trabajo se propuso un nuevo ligando de afinidad de bajo costo para la recuperación y purificación de lactoferrina bovina (Lf) y así contribuir al desarrollo industrial. La lactoferrina (Lf) es una glicoproteína que está presente en secreciones externas de mamíferos y es moduladora del metabolismo del hierro, promotora de la flora intestinal, actúa como factor de crecimiento y maduración de células intestinales y es anticancerígena, antimicrobiana, antiviral y antioxidante. Desde el punto de vista industrial, la utilización de colorantes triazínicos como ligandos resulta atractiva por su beneficiosa relación costo/selectividad. Este tipo de ligandos se caracteriza por su bajo costo y su alta estabilidad química, térmica y mecánica. Entre los colorantes triazínicos para la purificación de Lf se probaron el Red HE-3B y el Yellow HE-4R. El objetivo fue inmovilizar ambos colorantes sobre Sepharose4B para testear la purificación de Lf. Metodología Síntesis de las matrices. Los colorantes Red HE-3B y Yellow HE-4R fueron inmovilizados sobre Sepharose 4B. A 50 mg del colorante disuelto en 2 ml de agua destilada y 1 ml de NaCl 4 M se añadieron 2 ml de una suspensión de Sepharose 4B (50% en agua). Después de 60 min de agitación, se añadieron 100 μl de NaOH 10 M y la suspensión se llevó hasta un volumen final de 10 ml con agua. Luego de 10 h de agitación, la temperatura se elevó a 40°C y se mantuvo durante 4 h. Por último, la matriz se lavó con agua, metanol, NaCl 2 M y NH4Cl 1 M. Estas matrices se denominan, S-R y S-Y, respectivamente. Isotermas de adsorción. Se realizaron a pH 7,0, enfrentando concentraciones crecientes de solución de Lf pura (0,063 a 10 mg/ml) en un volumen de 1 ml con 50 mg de las matrices S-R y S-Y, durante 10 h a temperatura ambiente. El buffer utilizado fue buffer de fosfatos 20 mM, pH 7,0. La concentración de Lf en las soluciones se midió por absorbancia en 280 nm y la cantidad de proteína adsorbida a la matriz se calculó como la diferencia de concentración de Lf en el sobrenadante antes y después del proceso adsortivo. Estudio de elución. 50 mg de las matrices S-R y S-Y, previamente saturadas con Lf, se incubaron por 10 h con 1 ml de diferentes soluciones de elución. Diez soluciones de elución fueron probadas: (1) 2 M de NaCl, pH 7,0, (2) 2 M de NaCl, pH 9,0, (3) NaSCN 0,5 M, pH 7,0, (4) NaSCN 0,5 M, pH 9,0, (5) 25% etilenglicol, pH 7,0, (6) 25% etilenglicol, pH 9,0, (7) 25% etilenglicol con 0,5 M de NaSCN, pH 7,0, (8) 25% etilenglicol con 0,5 M de NaSCN, pH 9,0, (9) 25% etilenglicol con2 Mde NaCl, pH 7,0 y (10) 25% etilenglicol con2 Mde NaCl, pH 9,0. Para los eluyentes de pH 9,0 se utilizó buffer carbonato 20 mM. La concentración de Lf eluida se determinó espectrofotométricamente en 280 nm. Pre-tratamiento del suero de queso. La grasa residual del suero de queso se eliminó por precipitación termocálcica. Brevemente, 0,12 g de Ca2+, como CaCl2, se añadieron a 100 ml del suero con agitación suave a 2°C y se aumentó el pH a 7,4 con NaOH 2 M. La mezcla se incubó durante 8 min a 50°C y se centrifugó a 5000 g durante 10 min a 4°C. Proceso de purificación. El proceso adsortivo se realizó en modo batch enfrentando 1 ml del suero de queso clarificado con 25 mg de cada matriz durante 10 h a temperatura ambiente y con agitación suave. Luego de tres lavados con el buffer de fosfatos 20 mM con 0,5 M de NaCl, pH 7,0, se eluyó la proteína adsorbida con 0,5 ml de 25% de etilenglicol con 2 M de NaCl, pH 7,0 durante 10 h con agitación suave. Las matrices se reutilizaron en otros 2 ciclos consecutivos sin tratamiento de regeneración. El seguimiento de los procesos fue monitorizado por un ELISA comercial y SDS-PAGE 15%, y las proteínas totales se determinaron por el método de Bradford. Resultados Para caracterizar termodinámicamente las matrices, se realizaron las isotermas de adsorción, observándose que los valores de Kd obtenidos (0,1 mg/ml) fueron en el mismo orden de magnitud que la concentración de Lf en el suero de queso (0,08-0,1 mg/ml), lo que indica que estos ligandos aseguran una eficiente adsorción de Lf del suero de queso. Las capacidades máximas de adsorción para Lf obtenidas a pH 7,0 utilizando las matrices S-Y y S-R fueron de 40,2 y 27,8 mg/g, respectivamente. Al evaluar la eficiencia de los eluyentes testeados, se pudo observar que 25% etilenglicol con 0,5 M de NaSCN y 25% etilenglicol con 2 M de NaCl, a pH 7,0 o 9,0, fueron los mejores eluyentes para la desorción de Lf con porcentajes de elución mayores al 71%. Sin embargo, es preferible seleccionar 25% etilenglicol con 2 M de NaCl como eluyente en lugar de 25% etilenglicol con 0,5 M de NaSCN ya que este último no está permitido en la industria alimentaria y tiene un costo más alto. Dado que no se encontraron diferencias en capacidad entre los valores de pH del eluyente, se eligió el pH 7,0 para evitar la modificación del pH del suero. La matriz S-Y fue la que mostró una mejor performance del proceso de purificación a partir del suero de queso, con una adsorción del 98% de la Lf, una elución del 65% de la proteína adsorbida, un factor de purificación de 33 y un rendimiento del proceso del 63%. Para la matriz S-R la adsorción fue del 98%, la elución del 45%, el factor de purificación de 42 y el rendimiento global del 44%. Durante los tres procesos de purificación, las matrices mostraron valores de adsorción similares, mientras que los valores de elución aumentaron ligeramente en el tercer ciclo. Sin embargo, la matriz S-Y mostró valores más altos de elución que S-R, lo que resulta en un rendimiento más alto. Una característica importante del proceso de purificación de Lf fue que la pureza del producto obtenido en un único paso, determinada por SDS-PAGE, fue de 95 y 92% para las matrices S-Y y S-R, respectivamente. Conclusiones Los procesos de purificación utilizando la matriz con el colorante Yellow HE-4R mostraron un mejor rendimiento que las matrices con el colorante Red HE-3B. La matriz S-Y fue capaz de unir selectivamente la Lf a partir del suero de queso, recuperando la Lf con un alto grado de pureza en un solo paso. Por lo tanto, se logró encontrar un ligando de afinidad que permitió su purificación de Lf en una única etapa a partir del suero de queso. La performance de la matriz S-Y durante los tres ciclos de reutilización no varió significativamente. Por lo tanto, este ligando (Yellow HE-4R) se presenta como una alternativa atractiva para un proceso de purificación de Lf directamente del suero de queso.
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