INVESTIGADORES
WOLMAN Federico Javier
congresos y reuniones científicas
Título:
Producción de la lectina aglutinina de germen de trigo recombinante utilizando larvas de insectos como biofábricas
Autor/es:
NICOLÁS URTASUN; MARÍA FERNANDA BAIELI; OSVALDO CASCONE; FEDERICO JAVIER WOLMAN; MARÍA VICTORIA MIRANDA
Lugar:
Santa Fe
Reunión:
Congreso; SaProBio 2014. 3º Simposio Argentino de Procesos Biotecnológicos; 2014
Institución organizadora:
UNL
Resumen:
Introducción Las lectinas son un grupo de proteínas ubicuas que comparten la propiedad de unir carbohidratos de forma específica y reversible. Se hallan ampliamente distribuidas en la naturaleza y se han identificado en bacterias, virus, plantas, vertebrados e invertebrados. La capacidad de unir de manera específica carbohidratos, hace que las lectinas posean un alto valor agregado asociado a las múltiples aplicaciones biotecnológicas en que pueden ser utilizadas. En el presente trabajo de investigación se estudió el sistema de expresión de proteínas recombinantes basado en baculovirus como posible plataforma de producción de la lectina vegetal aglutinina de germen de trigo (del inglés Wheat Germ Agglutinin, WGA). La WGA es una proteína dimérica cuyos monómeros presentan 4 dominios unidos por 16 puentes disulfuro. El objetivo del trabajo fue establecer una estrategia para su producción y purificación a partir de larvas de Rachiplusia nu, lepidóptero considerado plaga de nuestro país. Metodología Virus: Los baculovirus recombinantes utilizados fueron del virus de la poliedrosis nuclear Autographa californica (AcMNPV). Los mismos se generaron a partir de la recombinación de vectores de transferencia con el gen sintético de la isoforma A de WGA (WGA A) y el genoma del baculovirus occ+ (poliedrina positivo). El virus fue amplificado en cultivos celulares de Sf9 y titulado utilizando protocolos establecidos para tal fin. Cría de insectos: Las larvas de R. nu fueron adquiridas en AgIdea S.A. (Pergamino, Bs. As., Argentina). Las mismas fueron criadas en nuestro laboratorio a partir de huevos o del primer o segundo estadio larval. La alimentación consistió en una dieta especial a base de soja. Se las mantuvo en una cámara a 27 °C, con una humedad del 70% y con un ciclo de luz-oscuridad de 16:8. Las larvas se criaron hasta alcanzar el último estadio larval (aproximadamente 15 días). Infección de larvas por vía oral: Cuando las larvas alcanzaron aproximadamente 1 cm de longitud se las hambreó durante toda la noche. Al día siguiente, se mezclaron porciones de alimentos (0,125 cm3) con 1 x 105 poliedros purificados según protocolos ya estandarizados. A las 24 horas se las alimentó normalmente. Al 3° día se realizaron homogenatos de larvas con una solución de lisis (HCl 50 mM, NaCl 150 mM, PMSF 1 mM, Triton X-114 4%). Proceso de purificación: El homogenato se calentó durante 4 min a 30 °C a fin de inducir la separación de dos fases y luego se centrifugó a 10000 x g durante 10 min a 24 °C. Se evaluaron matrices cromatográficas a base de quitosano entrecruzado con dos concentraciones diferentes de epiclorhidrina, 250 mM (CH250) y 500 mM (CH500) sintetizadas íntegramente en nuestro laboratorio. El pH de la fase superior fue ajustado a 5,0 o 8,5 y se dejó overnight a 24 °C en contacto con las matrices cromatográficas con agitación suave. Después de 4 lavados de 1 h a 24 °C, se procedió a la elución con una solución de ácido acético 1 M (overnight a 24 °C con agitación). El seguimiento del proceso de purificación se realizó por medición de WGA A a través del ensayo de ELISA de captura desarrollado en nuestro laboratorio, HPLC en fase reversa y un ensayo de hemaglutinación. Resultados Los niveles de expresión de WGA A alcanzados en larvas de R. nu fueron de 346,64 ± 88,65 μg de WGA A/g de larva (5 larvas aproximadamente). Para la purificación de la WGA A recombinante se diseñó una estrategia de bajo costo. Una vez obtenidos los homogenatos con un buffer de lisis conteniendo Tritón X-114, fueron sometidos a temperatura para inducir la separación de dos fases. La WGA A particionó selectivamente en la fase superior, mientras que la fase inferior (enriquecida en el detergente) concentró el debris celular y los lípidos presentes en el homogenato. La fase superior clarificada conteniendo el producto recombinante fue acondicionada a pH 5,0 o 8,5 con el fin de evaluar la adsorción de la WGA A a las matrices cromatográficas CH250 y CH500. Se pudo recuperar el 80% de WGA A en un único paso y con un nivel de pureza del 75% (estimado por HPLC) con la matriz CH250, realizando la adsorción a pH 5,0. La WGA recombinante expresada en larvas R. nu presentó capacidad de reconocimiento de residuos glicosilados presentes en la ovoalbúmina (ELISA) y capacidad de aglutinación de glóbulos rojos humanos, evidenciando el correcto plegamiento de la proteína recombinante y la correcta formación de los 16 puentes disulfuros intracatenarios de cada monómero. El nivel de WGA A expresado en este trabajo es 10 veces superior al previamente reportado en levaduras. Conclusiones El sistema de expresión de proteínas recombinantes basado en baculovirus y larvas de R. nu como biofábricas demostró ser una plataforma viable para la producción de la lectina WGA A. El costo de producir en larvas plagas es sumamente conveniente en comparación a otros sistemas tradicionales siempre que se asocie con un método de purificación sencillo y adecuado para la aplicación de la lectina.
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