Caracterización cinética de una metalo-β-lactamasa (LRA-12) proveniente del metagenoma ambiental de suelos de Alaska

M. M. RODRÍGUEZ; B. GHIGLIONE; J. DI CONZA; L. MOE; M. PÉREZ GARÓFALO; E. BLATEZKY; FEDERICO JAVIER WOLMAN; J. HANDELSMAN; G.GUTKIND; P. POWER

CABA

Jornada; 157 Jornada Científica de la Academia de Nacional de Farmacia y Bioquímica ?Resistencia bacteriana y uso racional de los antibióticos?; 2013

Academia de Nacional de Farmacia y Bioquímica

Introducción: La metagenómica incluye una serie de metodologías destinadas a la recuperación directa de genes o proteínas a partir de microorganismos no cultivables, comprendiendo generalmente la obtención de genotecas en Escherichia coli, y evitando el uso de técnicas de cultivo. De esta manera, varios genes de resistencia a antibióticos provenientes del metagenoma ambiental han sido descubiertos en muestras de suelo de Alaska, como genes codificantes de β‐lactamasas de las cuatro clases moleculares según Ambler. En este trabajo, nos hemos enfocado en el análisis fenotípico y bioquímico (propiedades cinéticas) de una metalo‐β‐lactamasa (MBL) de clase B3, denominada LRA‐12, previamente aislada de una muestra de suelo de Alaska. Métodos: El gen blaLRA‐12 fue clonado en vectores apropiados para evaluar el perfil de susceptibilidad a antimicrobianos en E. coli, de acuerdo a las recomendaciones de CLSI. LRA‐12 fue además producida a partir de sistemas de sobre‐expresión, y la MBL fue purificada hasta homogeneidad por cromatografía de afinidad por níquel e intercambio iónico. Los parámetros cinéticos en el estado estacionario (steady‐state) fueron determinados para antibióticos β‐lactámicos, y las constantes de inhibición por ensayos competitivos para inhibidores. Resultados: LRA‐12 posee 61% de identidad aminoacídica con las MBL de la familia GOB provenientes de Elizabethkingia meningoseptica. Además, mostró un 41% y 33% de identidad con FEZ‐1 (Fluoribacter gormanii) y BJP‐1 (Bradyrhizobium japonicum), respectivamente, dos enzimas de clase B3 cuyas estructuras cristalográficas fueron previamente resueltas. Los clones productores de LRA‐12 fueron resistentes a todos los β‐lactámicos ensayados, excepto aztreonam, y mostraron inhibición por EDTA. La enzima purificada mostró eficiencias catalíticas elevadas hacia la mayoría de los β‐lactámicos excepto monobactámicos (que se comportaron como inhibidores), de acuerdo al comportamiento esperado para una MBL. Conclusiones: Los resultados respaldan la hipótesis acerca del origen de muchas β‐lactamasas que residen en los genomas bacterianos de especies ambientales. Estas β‐lactamasas pueden poseer una actividad nativa de amplio espectro compatible con las enzimas presentes en patógenos clínicos, y sus genes codificantes, de ser reclutadas por elementos de diseminación, podrían ser transferidas a bacterias asociadas al hombre y producir enzimas que directamente otorguen un perfil de resistencia elevada.