SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE UNA NUEVA MATRIZ CROMATOGRÁFICA DE AFINIDAD PARA LA PURIFICACIÓN DE GLICOMACROPÉPTIDO

MARÍA F. BAIELI; OSVALDO CASCONE; FEDERICO J. WOLMAN

CABA

Congreso; ETIF 2012; 2012

ETIF

El quitosano es el derivado desacetilado de la quitina y es un co-polímero lineal de residuos 2-acetamida-2dioxi-β-D-glucosa (GlcNAc) y 2-amino-2-dioxi-β-D-glucosa (GlcN) distribuidos aleatoriamente. Es soluble en medio ácido e insoluble en medio básico. Se ha reportado el uso del quitosano como matriz cromatográfica dado que presenta como ventajas su bajo costo, alta disponibilidad y ser biodegradable, biocompatible y no tóxico. La aglutinina de germen de trigo (WGA) es una lectina de aproximadamente 35 kDa con alta especificidad por el ácido siálico. Por esta razón la WGA puede ser utilizada para la purificación de glicoconjugados. En la manufactura del queso la k-caseína se hidroliza generando dos fragmentos, el glicomacropéptido (hidrofílico) y la para-k-caseína (hidrofóbico). El glicomacropéptido (GMP) tiene carácter ácido y es altamente glicosilado. La fracción glicosilada consiste en ácido N-acetilneuramínico (ácido siálico), galactosa y N-acetilgalactosamina. El GMP es la única proteína del suero que contiene ácido siálico y carece de aminoácidos aromáticos, haciendo posible su utilización como suplemento alimentario para personas con fenilcetonuria. El objetivo de este trabajo fue evaluar las mejores condiciones de síntesis de una nueva matriz cromatográfica de afinidad para la purificación de GMP. Se desarrollaron mini-esferas a base de quitosano con WGA inmovilizada. La matriz se caracterizó y evaluó respecto de la adsorción y posterior elución de GMP. Metodología Síntesis de las mini-esferas. Se obtuvieron por goteo de soluciones de quitosano (peso molecular medio o de baja viscosidad) al 2% en ácido acético (2 o 4%) con y sin agregado de PEG600 1% sobre NaOH (0.5 o 2M). Las mini-esferas fueron entrecruzadas con una solución de epiclorhidrina 250mM pH 10, 60º C, 4 h. Se generaron 7 matrices (A-G) de acuerdo al tipo de quitosano, a las concentraciones de ácido acético y NaOH y al agregado o no de PEG600. Generación de las matrices de quitosano con WGA inmovilizada. Para la adsorción de WGA a las matrices se utilizó un extracto de WGA obtenido previamente (Baieli et al., 2012). Se utilizaron dos relaciones: 3g de matriz por 30 (1/10) o 150ml (1/50) del extracto. Parte de cada una de las matrices fueron entrecruzadas con glutaraldehído 0.05%, pH 7 durante 1h para unir covalentemente la WGA. Ensayo de adsorción y elución de GMP. La adsorción de GMP se testeo a pH 4, 5, 7 y 8.5 incubando 25mg de cada matriz (20 matrices) con 1ml de una solución 1mg/ml de GMP. La concentración de GMP se determinó por absorbancia en 230nm. La elución se llevó a cabo, tras 3 lavados con buffer de adsorción, enfrentando las matrices con una serie de 16 eluyentes. Resultados Generación de las matrices de quitosano con WGA inmovilizada. Las matrices generadas utilizando el quitosano de baja viscosidad (D y E) mostraron tener las mayores capacidades de adsorción de WGA cuando se utilizó una relación de 1/50. Ensayo de adsorción y elución de GMP. A pH 4 y 5 no se observó una unión considerable de GMP a las matrices. Por otro lado, a pH 7 y 8.5 todas las matrices con WGA entrecruzada mostraron mayores capacidades de adsorción de GMP que las matrices con WGA sin entrecruzar. A ambos pH la adsorción fue similar con capacidades entre 15-23mg GMP/g matriz. Por último, en el rango estudiado, la densidad de ligando no mostró una diferencia significativa para la adsorción de GMP. El mejor eluyente fue la GlcN 1M pH7, permitiendo la recuperación del 88% del GMP unido a la matriz. Conclusiones Se estudiaron diferentes condiciones para la síntesis de las matrices mediante el cambio en las concentraciones de ácido acético y NaOH y el tipo de quitosano. Los resultados obtenidos son extremadamente alentadores. Se sintetizaron matrices cromatográficas a base de quitosano entrecruzado con epiclorhidrina con WGA inmovilizada y entrecruzada. Dichas matrices mostraron adsorción y elución de GMP puro. Por lo tanto, las mismas tienen una aplicación prometedora para la purificación del GMP a partir de suero de queso. Además, las matrices generadas son de bajo costo, fácil de fabricar y manipular, sin necesidad de etapas de centrifugación para su recuperación y presentan una elevada resistencia mecánica.