INVESTIGADORES
WOLMAN Federico Javier
congresos y reuniones científicas
Título:
Desarrollo de una nueva plataforma para la expresión y purificación de lactoferricina bovina recombinante
Autor/es:
NICOLÁS URTASUN; MARÍA F. BAIELI; PABLO ROMASANTA; M. M. FERNÁNDEZ; E. L. MALCHIODI; OSVALDO CASCONE; FEDERICO J. WOLMAN; MARÍA V. MIRANDA
Lugar:
CABA
Reunión:
Congreso; ETIF 2012; 2012
Institución organizadora:
ETIF
Resumen:
Resumen La lactoferricina bovina (Lfcin B) es un péptido catiónico de peso molecular 3124 Da que deriva de la fracción Phe17- Phe41 del extremo amino de la lactoferrina(Lf) bovina y constituye un potente antibacteriano. Exhibe mayor actividad específca que la lactoferricina humana, murina o caprina. Además, presenta actividad antifúngica, antiviral, insecticida, antiparasitaria, antitumoral y posee efecto sinérgico con varios medicamentos convencionales. La principal fuente de obtención de la Lfcin B es por hidrólisis con la enzima pepsina de la Lf bovina previamente purifcada del suero de queso. Por otra parte, la expresión recombinante de Lfcin B en Escherichia coli o Pichia methanolica resulta tóxica para estos microorganismos. En este trabajo, se estudió la expresión de Lfcin B y Lfcin B fusionada a glutatión?S-transferasa (Lfcin BGST) en el sistema baculovirus/ células de insecto. Al ser dirigida la expresión de Lfcin B-GST al medio de cultivo se obtuvo un rendimiento de 13,72 ± 0,01 mg/l de cultivo (1,12 ± 0,01 mg de Lfcin B/l) mientras que al ser acumulada en citoplasma se obtuvo un rendimiento de 17,95 ± 3,86 mg de Lfcin B-GST/l de cultivo (1,93 ± 0,41 mg de Lfcin B/l). Estos valores resultaron ser aproximadamente 10 veces mayores con respecto a la expresión del péptido sin la proteína de fusión GST. Se midió la afnidad de Lfcin B a 5 colorantes triazínicos por Resonancia Plasmática de Superfcie (Biacore, GE) con el fn de seleccionar alguno de ellos como posible ligando de aplicación para su purifcación. El colorante Yellow HE-4R (Kd= 1,1 ± 0,3 x 10-7 M) fue el que mostró la mayor afnidad por Lfcin B seguido del Red HE-3B (Kd= 1,6 ± 0,4 x 10-5 M). Estos ligandos fueron inmovilizados sobre Sepharose 4B y se realizaron ensayos de purifcación en batch de Lfcin B-GST a partir de sobrenadantes de células de insecto sf9. Los procesos de purifcación se realizaron sin previo acondicionamiento del medio de cultivo (pH 6,4; conductividad 7 ms/cm) con las matrices Yellow Sepharose y Red Sepharose. El mayor rendimiento -65%- se logró con la matriz Yellow Sepharose al utilizar 2 M de NaCl con 25% de etilenglicol, pH 10 como eluyente. Dada la viabilidad del sistema baculovirus/células de insecto para la correcta expresión del péptido recombinante se espera incrementar los niveles de producción mediante el traslado del proceso a larvas de lepidópteros. Este esquema productivo, acoplado al uso de colorantes triazínicos como ligandos de afnidad para la purifcación del péptido, tiene la ventaja de su bajo costo por sobre otras tecnologías en uso.