Cribado para la optimización de la producción enzimática fúngica a partir de una gramínea autóctona local

PELLIERI, MARTÍN; BORTOLATO, SANTIAGO ANDRES; GISELA ,TUBIO

Buenos Aires

Simposio; IV Simposio Argentino de Procesos Biotecnológicos; 2016

Universidad Nacional de Quilmes

Cribado para la optimización de la producción enzimática fúngica a partir de una gramínea autóctona local. Carlos Martín Pellieri1, Santiago Andrés Bortolato2, Gisela Tubio11Departamento de Tecnología. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas - Universidad Nacional de Rosario. IPROByQ (CONICET). Suipacha 531 - S2002LRK - Rosario, Argentina. 2 Departamento de Química Analítica. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas - Universidad Nacional de Rosario. IQUIR (CONICET). Suipacha 531 - S2002LRK - Rosario, Argentina. tubio@iprobyq-conicet.gob.arResumen Las enzimas son biocatalizadores que se han empleado en la industria desde antaño. Pueden ser obtenidas a partir de tejidos animales, vegetales o de fermentación empleando microorganismos. Su producción industrial requiere niveles variables de calidad y cantidad, y el elevado costo de las materias primas utilizadas resulta una limitante. Sin embargo el empleo de materiales lignocelulósicos sin valor comercial representa una alternativa a esta problemática. Los hongos filamentosos Thermomyces lanuginosus y Aspergillus niger son excelentes productores de enzimas industriales principalmente por sus altos niveles de secreción de proteína En el presente proyecto se propone diseñar una metodología de producción de extractos fúngicos extracelulares con actividad xilanolítica utilizando Spartina argentinensis como única fuente de carbono por fermentación en estado sólido y líquido, mediante el empleo de técnicas de diseño experimental. Palabras clave xilanasa; Aspergillus niger; Thermomyces lanuginosus, Spartina argentinensis.1. Introducción Las xilanasas (xil) catalizan la degradación del xilano, estas enzimas presentan gran interés biotécnológico ya que su empleo en los procesos industriales ofrece una serie de ventajas como elevada eficiencia, bajo impacto medioambiental y una mejor rentabilidad económica respecto a los procesos industriales convencionales. La obtención de extractos crudos enzimáticos que sustituyan enzimas comerciales representa un ahorro económico considerable, especialmente cuando la fuente de producción de enzimas es una gramínea como Spartina argentinensis (S. argentinensis), la cual posee tejidos ricos en xilano, celulosa y lignina. Esta planta sin valor comercial, se desarrolla con altas tasas de crecimiento en los bajos submeridionales de Santa Fe, por lo que el beneficio de su empleo es mayor. El objetivo de este trabajo fue determinar los factores significativos para ser empleados en la optimización de la producción de xilanasa fúngica, cuando se emplea S. argentinensis como única fuente de carbono.2. Metodología Se utilizó un diseño factorial en bloques (DFB) para tres factores y dos niveles (23). Los bloques permitieron analizar el tipo de hongo filamentoso a emplear en las fermentaciones: Thermomyces lanuginosus (T. lanuginosus) y Aspergillus niger (A. niger). Los factores y niveles utilizados fueron: tipo de hoja de S. argentinensis (verde o senescente), tipo de fermentación (líquida o sólida) y concentración del inóculo (105 o 106 conidios/mL), estos últimos se determinaron por recuento en cámara de Thoma (Kammoun y col., 2008). La fermentación se llevó a cabo en matraces Erlenmeyer en un volumen de 100 mL en medio líquido (FML) y a saturación de humedad en los medios sólidos (FMS), en ambos casos conteniendo hojas de S. argentinensis en medio basal con buffer fosfato 50mM pH 6, incubando a 30ºC en agitación orbital a 150 rpm según correspondiera. Se utilizaron 2 gramos de hojas verdes y 2,78 gramos de hojas senescentes con el objetivo de que cada medio de cultivo contenga la misma cantidad de hemicelulosa (Larran y col., 2015) con un tamaño de partícula de 3x2x1 mm determinado por molienda. Cada 24hs se tomó una alícuota de cada sistema y se determinó actividad xil basados en el de Miller modificado (Bayle, 1992), presencia de azúcares reductores por el método colorimétrico del ácido 3,5 dinitrosalisílico (DNS) (Miller, 1959) y concentración de proteínas totales por el método del ácido bicinconinico (Smith y col, 1985). Los resultados obtenidos fueron analizados con el programa MINITAB versión 17.3. Resultados y DiscusiónEl análisis de la variancia (ANOVA: del inglés ANalysis Of VAriance) obtenido para la respuesta en estudio (actividad xilanolítica expresada en U), permite identificar los factores que influyen significativamente en el proceso de producción xilanolítica fúngica. El análisis del modelo presento un valor de 32,58 lo cual indica que el mismo es significativo y sólo hay un 3% de probabilidad de que las variaciones en las respuestas obtenidas se deban a ruido instrumental. El efecto bloque resultó significativo (p=0,008), sugiriendo que el empleo de uno u otro microorganismo es significativo, en medio sólido con hojas verdes como fuente de carbono y una concentración de inóculo de A. niger de 105 conidios/mL se obtuvo el mayor valor de actividad (1636,5 U) cuarenta veces superior al mismo medio pero inoculado con T. lanuginosus. Los factores tipo de hoja y la interacción entre el tipo de hoja y la concentración del inóculo resultaron significativos para este modelo, en ambos casos los valores de p-value resultaron menores a 0,05, con un grado de confianza del 95 %. El resto de las interacciones doble de los factores resultaron no significativas, alcanzando p-values de 0,226. 5. Conclusiones Los resultados obtenidos permiten seleccionar a A. niger como el mejor microorganismo productor de enzimas y elegir los factores: tipo de sustrato y concentración de inóculo, para diseñar una estrategia de optimización de la producción de xilanasa fúngica representando una importante contribución para el establecimiento de un nuevo procedimiento de fermentación usando sustratos sin valor agregado. 6. Bibliografía Bailey, M.J., P. Biely, and Poutanen, K. (1992). Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity. Journal of Biotechnology, 23(3), 257-270.Kammoun, R., Naili, B., Bejar, S. (2008). Application of a statistical design to the optimization of parameters and culture medium for amylase production by Aspergillus oryzae CBS 819.72 grown on gruel (wheat grinding by-product). Bioresource Technology, 99(13):5602-9Larran, A., Jozami E., Vicario, L., Feldman, S.R., Podestá, F. E., Permingeat, H.R. (2015). Evaluation of biological pretreatments to increase the efficiency of the saccharification process using Spartina argentinensis as a biomass resource. Bioresource Technology, 194:320-5Miller, G.L. (1959). Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for Determination of Reducing Sugar. Analytical Chemistry, 31(3), 426-428.Smith, P.K., et al. (1985).Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemestry, 150, 76-85.7. Agradecimientos Este trabajo fue subsidiado con los proyectos: Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica (PICT2013-1730) y SeCyT-UNR BIO338.EJE TEMATICO: Fermentación microbiana y biotransformaciones.