Estudio de la interacción entre tripsina y alginato empleando ITC y DLS

BRAIA, MAURICIO; LOUREIRO, DANA B.; TUBIO, GISELA; ROMANINI, DIANA

Buenos Aires

Congreso; XIX Congreso Argentino de Fisicoquímica y Química Inorgánica; 2015

Asociacion Argentina de Investigación Fisicoquimica

La tripsina (TRP) es una enzima ampliamente utilizada en la industria como ablandador de carne y cuero, clarificador de bebidas y componente de detergentes enzimáticos, entre otros [1]. Su alta demanda ha motivado el desarrollo de técnicas de aislamiento y purificación que permitan obtenerla de manera simple, económica y con elevados rendimientos y factores de pureza. Desde nuestro laboratorio proponemos técnicas que implican el uso de polielectrolitos (PEs) con carga opuesta a la TRP, los cuales pueden interaccionar con la misma formando complejos insolubles que se separan de los contaminantes solubles por decantación o centrifugación. La formación de estos complejos depende tanto del pH como de la temperatura, la fuerza iónica, la relación de concentraciones, la densidad de carga de las mismas, etc [2]. El primer paso hacia el aislamiento de cualquier enzima empleando PEs es la determinación de las condiciones óptimas de interacción [3, 4]. Para ello, se han empleado dos técnicas de vanguardia como la calorimetría de interacción isotérmica (ITC) y la dispersión de luz dinámica (DLS). Tanto los experimentos de ITC como DSC fueron realizados en tres condiciones diferentes: pH 3,5; pH 3,5 NaCl 1 M y pH 8,2.Los experimentos de ITC realizados a pH 3,5 demostraron que la interacción entre TRP y ALG es una reacción exotérmica (ΔH° = -2970 cal/g y ΔS° = -26 cal/g/K) con una constante de afinidad igual a 2,8e3 M-1. La relación molar a este pH fue igual a 232 µmoles de TRP por gramo de ALG. Por otro lado, la TRP no interaccionó con el ALG en presencia de elevada fuerza iónica y a pH 8,2. Estos datos demuestran que la interacción entre ambas moléculas es netamente electrostática.Los experimentos de DLS mostraron que cuando la TRP y el ALG se mezclan a pH 3,5 forman un complejo con un Rh igual a 185 nm. En presencia de una elevada fuerza iónica o a pH 8,2, las partículas del sistema presentaron tamaños diferentes al del complejo formado a pH 3,5. Incluso, los Rh calculados a pH 8,2 coinciden con los calculados para el ALG a este pH. Esto indica que no existe interacción entre ambas moléculas en estas condiciones y se corroboran así los resultados del ITC.Estos resultados permiten conocer las condiciones óptimas de formación del complejo TRP-ALG (pH 3,5 y 232 µmoles TRP/gr ALG) y de solubilización (alta fuerza iónica o aumento del pH) para poder obtener a la TRP en su forma soluble, libre del ALG.[1] Margot, A.; Flaschel, E.; Renken, A. (1998) Development of a continuously operated reactor for the hydrolysis of whey protein by trypsin. Process Biochem 33(2) 125-131.[2] Rocha, C.; Gonçalves, M.P.; Teixeira, J.A. (2011) Immobilization of trypsin on spent grains for whey protein hydrolysis. Process Biochem 46 505-511.[3] Braia, M.; Porfiri M. C.; Farruggia, B.; Picó, G.; Romanini, D. (2008) Complex formation between protein and poly vinyl sulfonate as a strategy of proteins isolation. J Chromatogr B 873 139-143.[4] Porfiri, M. C.; Braia, M.; Farruggia, B.; Picó, G.; Romanini, D. (2009) Precipitation with poly acrylic acid as a trypsin separation strategy. Process Biochem 44 1046-1049.