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Introducción En los últimos años la utilización de activadores dietarios se ha convertido en una práctica innovadora que mejora la ganancia diaria de peso de los animales destinados a la producción cuando su principal componente dietario son forrajes fibrosos de baja calidad nutritiva. La adición de enzimas con actividad sacarolítica en suplementos dietarios es una práctica que mejora la digestibilidad de fibras en alimentos como maíz, cebada, soja, sorgo o pasturas pobres. La presencia de enzimas como xilanasas, amilasas y celulasas permite la disminución de diarreas, el incremento del peso de los animales (monogástricos como pollos y cerdos o en rumiantes) y un aumento general de la salud de los mismos. El objetivo de este trabajo fue expresar dos enzimas involucradas en el metabolismo de azúcares, de amplio uso industrial, como lo son la α-amilasa y xilanasa para ensayar su posterior purificación a través de procesos innovadores para su aplicación a formulaciones alimenticias para animales monogástricos y rumiantes. Materiales y Métodos Se utilizaron como sistemas de expresión génica las cepas Escherichia coli y las bacterias lácticas (BAL) EnterococcusfaecalisJH2-2 y LactococcuslactisIL1403 [1], las que fueron cultivas en medios LB o M17, a excepción de Lc. Lactis para la cual se empleo únicamente el medio M17. Se utilizaron los genes amyE (codifica para la enzima α-amilasa) y xynA (codifica para la enzimaendo-1,4-β-endoglucasa o xilanasa) de Bacillus licheniformis y Bacillus subtilis. Para Es. coli se emplearon vectores pertenecientes a los sistemas convencionales de la serie pET y el plásmido pGAL9[2] que posee el origen de replicación promiscuo del plásmido pWV01, el marcador de resistencia a eritromicina (seleccionado con 200 µg/ml) y expresa la enzima α-amilasa de B .licheniformisen forma extracelular, debido a la fusión de una secuencia codificante para un péptido tránsito con el gen codificante para dicha enzima, y constitutiva a partir del promotor fágico PSPO2. Mientras que para las BAL se empleó el vector pGAL (seleccionado con eritromicina 5 µg/ml) y pNZ9000 (seleccionado con cloranfenicol 10 µg/ml). Las actividades enzimáticas en placa se determinaron para cada proteína. Las cepas poseedoras de actividad α-amilasa se confirmaron en placas M17 agar 1,5 % conteniendo almidón 1% (p/v) y glucosa 0,5 %, revelando la presencia de halo degradativo con solución lugol. La actividad xilanolítica se evidenció por la presencia de un halo claro. Las cepas correspondientes fueron cultivadas en medio LB agar 1,5 %, 200 µM IPTG (isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido) y xilano 0,3 % (p/v), cuya tinción se realizo con solución fresca de Rojo Congo al 0,25 % (p/v) durante 10 min y posterior lavado con NaCl 1 M durante 15 min. Adicionalmente, sobre los extractos celulares (EC) y sobrenadantes (SB) obtenidos se determinaron proteínas totales por el método de Lowry y se ensayó actividad amilasa y xilanasa por métodos colorimétricos basados en la propiedad de la enzima de hidrolizar los sustratos 2-cloro-p-nitrofenil-D-maltotriósido y xilano. En el primer caso, la velocidad de aparición de color es directamente proporcional a la actividad enzimática[3], mientras que en el segundo, indirecta, se cuantifican los azúcares reductores por el método de Miller[4]. Resultados El vector pGAL9 fue introducido por electroformación en Enterococcus faecalis JH2-2 seleccionando por la resistencia a eritromicina. Se evaluó la presencia de actividad degradativa de almidón en placas LB suplementado con almidón al 1 % (p/v) en distintas cepas obtenidas. Luego de 48 h de incubación a 37 ºC se reveló la presencia de halo degradativo por medio de la tinción de la placa con reactivo lugol. Las cepas de E. faecalis transformadas con pGAL9 (JH-pGAL), con actividad degradativa de almidón fueron: #1, # 2, # 4, #5, #7 y #8. Se observan los controles realizados de actividad amilasa utilizando la cepa de E. faecalis JH2-2, Lc. lactis IL1403 como control negativo y la cepa de E. coli transformada con este plásmido que le confiere actividad enzimática (control positivo). Por otro lado, utilizando la técnica de PCR, se amplificó el gen xynA de B. subtilis 168 con el par de oligonucleótidos xynA-BamHI -F / xynA-SalI-R y empleando ADN genómico de esta bacteria como molde. Se purifico el fragmento amplificado y se clonó en el vector pGEM-T easy empleando la cepa E. coli DH5α. Las colonias blancas seleccionadas se chequearon por PCR. Se realizó una preparación plásmidica de una de las cepas positivas. Posteriormente se determinó que la secuencia del inserto (xynA) fuera correcta y se continuó el clonado en el plásmido pET28 (b). Dicha construcción (pET28-xynA) se estableció en la cepa Es. coliBL21 (DE3) que permite la inducción de la expresión proteica del gen clonado por medio del agregado externo de IPTG. Se realizó una inducción a 30 ºC toda la noche en agitación de dos de las colonias aisladas de E. coliBL21 (#1 y #2) portadoras del plásmido pET28-xynA y una cepa control (E. coliBL21 con pET28 (b) sin inserto). Las condiciones fueron: sin agregado de IPTG y a 10 y 150 µM de IPTG. Los extractos celulares (EC) y sobrenadantes (SB) correspondientes se determinó actividad amilásica y xilanolítica alcanzando una actividad máxima de 293,93 U/ml en EC y 35,16 U/ml en SB, las que posteriormente se analizaron en un gel SDS-PAGE. En EC inducidos (#1 y #2) se pudo observar la inducción de al menos dos bandas correspondientes: una al peso molecular esperado de la proteína XynA (23,34 kDa) y otra a la proteína procesada (20,31 kDa) sin el péptido señal (primeros 19 aminoácidos de la secuencia) identificado por el programa SignalP 4.1 Server. Mientras que en el SB inducido (#1 y #2) sólo se observó la banda correspondiente a la proteína procesada (20,31 kDa). Conclusiones Se obtuvo de esta forma una BAL como E. faecalis con capacidad de degradar almidón a partir de la excreción de la enzima heteróloga α-amilasa. E. faecalis es una bacteria naturalmente resiste condiciones extremas para otras BAL, por lo que es una buena herramienta para aplicar actividades enzimáticas en fermentaciones en estado sólido de fibras de origen vegetal variando las condiciones de incubación. Se logró además expresar activa la enzima xilanasa bacteriana en un sistema de expresión eficiente (serie pET) y de manera extracelular compatible para futuros pasos de purificación enzimática como lo es la precipitación de afinidad empleando smart polímeros, como alginato, que lo convierte en un método de aislamiento y purificación de proteínas aplicable directamente sobre cultivos celulares sin clarificación previa. [1] Banka, A., S. Albayrak Guralp, et al. (2014). Applied Biochemistry and Biotechnology 174(8): 2702-2710. [2] Perez-Martinez, G., J. Kok, et al. (1992). Molecular and General Genetics MGG 234(3): 401-411. [3] K. Ishikawa, I. Matsui, K. Honda and H. Nakatani. Biochemistry, 29 (1990) 7119-7123. [4] L. Fengxia, L. Mei, L. Zhaoxin, B. Xiaomei, Z. Haizhen, W. Yi. BioresourceTechnology 99 (2008) 5938?5941

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