EMPLEO DE METODOLOGIAS DE AFINIDAD PARA LA BIOSEPARACION DE ALFA AMILASA A PARTIR CULTIVOS DE Asperguillus oryzae

MARINA, JORGELINA; ROMANINI, DIANA; TUBIO, GISELA

Rosario

Congreso; XVIII Congreso Argentino de Fisicoquímica y Química Inorgánica; 2013

Docentes FCByF UNR

Introducción: Alfa-amilasa (Amy) se encuentra entre las enzimas hidrolíticas más importantes para la industria biotecnológica con aplicaciones diversas, en especial en la panificación, donde la presencia de una cantidad suficiente de alfa-amilasa fúngica presenta ventajas para la fermentación por el desprendimiento gaseoso, aumento del volumen y textura de la masa, etc. El reparto de afinidad ha sido empleado satisfactoriamente para la purificación de proteínas industriales debido a la simplicidad que presenta esta tecnología para el escalado. Consiste en la extracción liquido-liquido empleando sistemas bifásicos acuosos (SBAs) utilizando un ligando libre que interacciona específicamente con la proteína que se desea aislar. Cuando es utilizado como ligando un polímero pueden acoplarse los SBAs a la precipitación de afinidad. El alginato forma un precipitado insoluble con calcio, el agregado de CaCl2 a cada fase permitiría precipitar el complejo alginato-amilasa-calcio. Un agregado posterior de maltosa favorecerá la redisolución del complejo dado que esta última presenta mayor afinidad por amilasa. Objetivos: Determinar las condiciones para la extracción de Amy a partir de cultivos de Asperguillus oryzae, empleando SBA formados por polietilenglicol (PEG) de pesos moleculares 1450, 3350 y 6000 y citrato de sodio a pH 6,00 y alginato como ligando de afinidad. Evaluar su posterior utilización en la precipitación de afinidad. Resultados: Se analizó el efecto de la concentración del ligando libre, el aumento de fuerza iónica en el medio y el peso molecular del PEG en el reparto de Amy (KrAmy) y proteínas totales (KrPT). Se observó que KrAmy aumento 25 veces cuando la concentración de alginato superó el 0,5% de la masa total del sistema, desplazando a la proteína mayoritariamente hacia la fase superior (KrAmy=4,8). Mientras que el aumento de NaCl en presencia de alginato aumenta 49 veces el coeficiente de reparto de Amy en sistemas formados por PEG6000 (figura1). Por otra parte el aumento del PM de PEG en presencia de alginato conduce a un considerable aumento en KrAmy (figura 2). La capacidad separativa de las PT respecto de alfa amilasa, indica que el SBA mas adecuado para ensayar la separación es el formado por PEG3350 y 0.15 % P/P de alginato. Conclusiones: Los resultados obtenidos indican que la metodología empleada podría ser combinada satisfactoriamente con la precipitación de afinidad, para la extracción en solución de alfa amilasa de Asperguillus oryzae.