Análisis de la estabilidad enzimática de xilanasa de Aspergillus niger en presencia cosulutos empleados en técnicas bioseparativas.

TADDIA, ANTONELA; LOUREIRO, DANA B.; TUBIO, GISELA

Rosario

Congreso; XVI Congreso XXXIV Reunión Anual.; 2014

Sociedad de Biología de Rosario

Las xilanasas (Xyl) son glicosil-hidrolasas que hidrolizan cadenas de xilopiranósido unidas mediante uniones beta-1,4. Junto con otras glicosil-hidrolasas, forman una superfamilia que incluye más de 40 familias de enzimas diferentes. Las características comunes para los miembros de esta familia son una alta homología genética, un tamaño de aproximadamente 20 kDa, y un mecanismo catalítico de doble desplazamiento. Sin embargo presentan diferentes características y conductas químicas de acuerdo a su origen y al medio en que se encuentran, las que se manifiestan cuando son empleadas para su extracción técnicas de bioseparación que utilizan polímeros de cadena flexible (PCF), como lo son como los sistemas bifásicos acuosos (SBAs). El objetivo de este trabajo fue estudiar la estabilidad de xilanasa de Aspergillus niger en ausencia y presencia de concentraciones variables de distintos cosolutos empleados en la técnica de extracción líquido ? líquido para formar SBAs. Para ello se incubó la proteína a 20°C en buffer citrato de sodio (Cit) 50 mM pH 5,30 y en presencia de los cosolutos: cloruro de sodio (NaCl) al 4 y 8%P/P, polietilenglicol (PEG) de peso molecular (PM): 1000, 2000, 4600 y 8000 al 10 y 30%P/P y citrato de sodio (NaCit) pH 5,20 al 12 y 25%P/P. La concentración final de Xyl fue de 9,8uM en todos los casos. Se tomaron alícuotas a tiempo cero y cada una hora durante tres horas, y se midió actividad xilanasa empleando el método colorimétrico del ácido 3,5 dinitrosalicílico (DNS), basado en la determinación de azúcares reductores. Como sustrato de reacción se utilizó una solución de xilano de haya al 1%P/P. Se observó que conforme aumenta el tiempo de incubación de la enzima en buffer Cit aumenta ligeramente la actividad enzimática mientras que, en general, no se observan variaciones considerables en las soluciones de PEG, NaCit y NaCl. Al aumentar la concentración de los cosolutos, la actividad enzimática no presentó variaciones en los medios conteniendo NaCl al 4 y 8%P/P sugiriendo que Xyl es estable a alta fuerza iónica del medio. A bajas concentraciones de PEG, para todos los PM ensayados, no se observaron variaciones significativas en la actividad enzimática sugiriendo que la presencia de los mismos no desestabilizan el sitio activo de la enzima. Sin embargo, el aumento de la concentración del polímero en los medios de incubación condujo a una considerable disminución de la actividad catalítica de Xyl indicando una desestabilización de la actividad. Un efecto similar al PEG se observó cuando la enzima se incubó en presencia de NaCit. Los resultados obtenidos permiten concluir que los cosolutos adicionados mantuvieron la estabilidad enzimática hasta las tres horas de incubación en el rango de concentraciones de trabajo. La presencia de PEG, NaCit y NaCl a bajas concentraciones no modificaron la actividad Xyl de A. niger, sin embargo fue alterada a altas concentraciones de PEG y NaCit, indicando de este modo, que los cosulutos seleccionados pueden ser muy convenientes para ser empleados a bajas concentraciones en técnicas bioseparativas como lo son los SBAs.