Aporte de genotipos obtenidos in vitro y por duplicación cromosómica para el estudio del modo reproductivo de Eragrostis curvula

SUSANA CARDONE; PABLO POLCI; JUAN P. SELVA; MARTÍN A. MECCHIA; SILVINA PESSINO; GERMÁN SPANGENBERG; VIVIANA ECHENIQUE

Buenos Aires, Argentina

Congreso; Congreso Internacional RedBio Argentina 2005; 2005

Introducción La apomixis es un modo de reproducción que involucra la propagación clonal a través de semilla. La expresión de este carácter está siempre relacionada con la poliploidía. En las especies apomícticas, las razas con bajos niveles de ploidía (usualmente diploides) se reproducen por sexualidad mientras que las poliploides lo hacen por apomixis. La herencia de la aposporía ha sido investigada en varias especies, no así la de la diplosporía (Van Dijk y Backx-Schotman, 2004). Mucho se ha especulado acerca de la posibilidad de transferir el carácter a especies de interés comercial. Para ello es necesario conocer el mecanismo molecular de control del mismo y sus posibilidades de expresión. También es indispensable contar con materiales apropiados que permitan establecer las bases del carácter, Eragrostis curvula es una especie que se reproduce por apomixis diplospórica (Voigt y Bashaw, 1972). En la misma los cultivares de mayor valor forrajero son tetraploides. Para proceder a Ia identificación del gen o los genes involucrados en este carácter contar con una línea tetraploide sexual sería de gran valor para establecer comparaciones de expresión de genes y generar poblaciones segregantes que permitan el mapeo genético. La misma podría utilizarse, además, con fines de mejoramiento. El objetivo de este trabajo fue describir un somaclon diploide proveniente del cultivo de inflorescencias de un cultivar tetraploide apomíctico de pasto llorón y una línea tetraploide obtenida a partir de su duplicación cromosómica y determinar si son útiles para la identificación y caracterización de los genes responsables de la reproducción apomíctica diplospórica en esta especie.   Metodología Se utilizó una regenerante primaria (R0) originada in vitro por cultivo de inflorescencias (Echenique et al, 1996). Esta planta redujo in vitro su dotación cromosómica y fue denominada UNST1122. Este material fue caracterizado morfológica y agronómicamente y comparado con el cultivar de origen y otros cultivares de uso corriente. A partir del somaclon UNST1122 se obtuvo una generación R1 de 30 plantas por polinización libre. Con fines comparativos se generaron, además, una población de clones (provenientes de macollos de UNST1122) y una población proveniente de semilla apomíctica del cv. Tanganyika. Se determinó el modo reproductivo de la línea UNST1122 por medio de análisis citoembriológicos y pruebas de progenie con datos morfológicos (altura de planta, ancho de hoja, perímetro de corona, producción de panojas y peso de semilla), bioquímicos (esterasas, peroxidasas y malatodeshidrogenasas) y moleculares( RAPDs). Se realizaron conteos cromosómicos, estudios de la microsporogénesis y de viabilidad del polen del somaclón y conteos cromosómicos de su progenie R1. A fin de proceder a la duplicación cromosómica del somaclón UNST1122, 500 semillas provenientes de una planta R1 del mismo se trataron con una solución de colchicina (500 mg/l). El nivel de ploidía de las plantas obtenidas fue determinado por citometría de flujo y corroborado con conteos cromosómicos. Se obtuvieron 2 plantas tetraploides que se denominaron UNST1112 y UNST1131. Se caracterizaron morfológicamente y se determinó su modo reproductivo utilizando marcadores de RAPDs.   Resultados y Discusión El somaclón UNST1122 se asemeja al cultivar de origen (Tanganyika) pero posee características que le son propias. Se trata de plantas vigorosas con una peculiar pubescencia en las hojas que son, además, más anchas y con lígula más pequeña. El conteo de los cromosomas de ápices de raíces de la regenerante primaria (R0 UNST1122) permitió determinar que la misma posee un complemento de 2n = 2x = 20, exactamente la mitad que el cultivar de origen Tanganyika (2n = 4x = 20). La planta UNST1122 mostró una meiosis sin irregularidades, con apareamiento en bivalentes y producción de polen normal y viable en un 96,50%. Los conteos cromosómicos de 26 plantas de la progenie R1 determinaron la presencia de plantas diploides (81%) y hexaploides. La aparición de plantas hexaploides fue un indicio de variabilidad en la progenie R1. Los estudios citoembriológicos indicaron un desarrollo sexual del megagametófito. En coincidencia con esto, los tests de progenie con datos morfológicos determinaron mayor variabilidad en la progenie R1 respecto de la población proveniente de semilla apomíctica. Los resultados de los tests de progenie utilizando isoenzimas y marcadores de RAPDs indicaron también una progenie R1 derivada de reproducción sexual detectando que el 87,7% de 28 plantas R1 diferían del patrón materno. Utilizando citometría de flujo se seleccionaron 10 plantas entre las 72 rescatadas del tratamiento con colchicina que mostraron evidencias de haber duplicado su dotación cromosómica. Los conteos cromosómico comprobaron que sólo dos de esas plantas poseían el número cromosómico buscado, 2n = 4x = 40. Las dos plantas tetraploides obtenidas responden al tipo agronómico "curvula" (llorón), con una morfología similar al cv. Tanganyika, con hojas angostas y glabras. El análisis del modo reproductivo de la planta UNST1131 por test de progenies utilizando RAPDs en ensayos duplicados evidenció que se trata de un genotipo sexual. Las progenies se obtuvieron por polinización libre. Se analizaron 7 plantas hijas presentando la totalidad de ellas un patrón de amplificación diferente al del genotipo materno, con desaparición de bandas y aparición de bandas nuevas. Los primeros 12 marcadores probados ya permitieron discriminar la totalidad de la progenie como provenientes de reproducción sexual. Cuando se realizó el mismo test sobre la planta otra planta tetraploide (UNST1112) también se detectaron patrones diferentes al de la madre en la totalidad de las plantas analizadas (8), pero fue necesario utilizar 64 marcadores de RAPDs para discriminar claramente a la totalidad de la progenie.   Conclusiones Los materiales desarrollados en este trabajo serán utilizados para identificar los genes responsables de la reproducción apomíctica diplospórica siguiendo dos estraegias diferentes y complementarias: 1) un procedimiento tradicional de mapeo, cruzando las plantas 4x sexuales con progenitores apomícticos adecuados del complejo E. curvula y 2) un enfoque transcriptómico, aprovechando la posibilidad de tener en un mismo trasfondo genético dos modos reproductivos diferentes, sexualidad y apomixis. Para ello se están analizando genotecas obtenidas a partir de inflorescencias de estas plantas con el objeto de se identificar genes expresados diferencialmente por display diferencial y obtención de ESTs.   Bibliogralía Echenique V.; P. Polci and L. Mroginski. 1996 Plant cell tissue and organ culture 46 123-130. Van Dijk and Backx-Schotman J. 2004 Genetics 166: 483-492. Voigt. P. And Bashaw E. 1972 Crop Sci. 12: 843-847.