Caracterización de la estructura del genoma y Ia expresión de genes en genotipos apomícticos y sexuales de Eragrostis curvula (pasto llorón)

MARTÍN A. MECCHIA; LUCIANO G. MARTELOTTO; JUAN P. SELVA; PABLO POLCI; SUSANA CARDONE; VIVIANA ECHENIQUE; SILVINA PESSINO

Buenos Aires, Argentina

Congreso; Congreso Internacional RedBio Argentina 2005; 2005

Introducción Eragrostis curvula (pasto llorón) es una especie forrajera extensamente cultivada en la zona semiárida templada del país. Constituye un grupo poliploide donde la mayoría de sus miembros se reproduce por apomixis obligada diplospórica de tipo pseudógama (Voigt y Bashaw 1972). Los proyectos de mejoramiento genético de Erogrostis curvula que se llevan adelante en el CERZOS (Bahía Blanca) generaron derivados dihaploides sexuales obtenidos por cultivo de tejidos a partir de plantas tetraploides apomícticas naturales. El tratamiento posterior de estos dihaploides con colchicina permitió regenerar nuevos tetraploides. El objetivo de este trabajo fue caracterizar genéticamente estos materiales (tetraploides naturales, dihaploides y colchiploides) e identificar genes que se expresen en forma diferencial en plantas apomícticas y sexuales.   Metodotogía Se utilizaron plantas del cultivar tetraploide diplospórico obligado Tanganyika (2n= 4x= 40), un dihaploide sexual derivado de Tanganyka por cultivo in vitro de inflorescencias inmaduras (2n= 2x= 20) y dos colchiploides sexuales derivados del dihaploide por tratamiento con colchicina (2n= 4x= 40). La estructura genética de las líneas fue analizada con las técnicas de RAPD y AFLP. Los estudios de expresión se hicieron utilizando differential display. Los clones derivados de ambos tipos de estudios fueron secuenciados por Macrogen Inc. (Corea). Los análisis de homología de secuencia se hicieron con el grupo de programas BLAST 2.0 del Nacional Center of Biotechnology Information.   Resultados y Discusión Las estructuras genéticas de las plantas T (Tanganyka), D (dihaploide), C y M (colchiploides) fueron analizadas por medio de 218 marcadores de RAPD y 180 marcadores de AFLP y posteriormente comparadas. Ambos tipos de marcadores revelaron polimorfismos entre las líneas tetraploides y el dihaploide (- 25% del total de bandas contadas). Curiosamente, todos los poliploides (natural y colchiploides) resultaron genéticamente muy similares, mientras que el dihaploide mostró una estructura diferente. La mayoría de las bandas que desaparecen o aparecen durante el paso de dihaploidización (- 22% del total de bandas contadas) vuelven a recuperarse o a perderse (respectivamente) luego de la duplicación con colchicina. Un alto número de polimorfismos está asociado con desaparición de bandas en el dihaploide, la mayoría de las cuales reaparecen en ambos colchiploides. La estructura de ambos colchiploides resultó idéntica. Estos resultados parecen indicar que durante el proceso de dihaploidización hay eliminación de secuencias del genoma, que son recuperadas durante la tetraploidización. Cuatro de las bandas polimórficas entre T y D fueron clonadas y secuenciadas. Dos de ellas no presentaron homologías de secuencia con genes conocidos. Las otras dos resultaron homólogas a las secuencias de una metilasa y una ATPasa soluble de tipo P, respectivamente. Se compararon perfiles de differential display obtenidos a partir de muestras de RNA de flores de las plantas T (diplospórica, tetraploide) y D (sexual, diploide). Las bandas diferenciales detectadas pueden ser genes cuya expresión está relacionada con el modo de reproducción y/o el nivel de ploidía. Se analizaron l0 combinaciones de cebadores. Tres bandas diferenciales fueron eluidas, reamplificadas, clonadas y secuenciadas. Una de las secuencias no presentó homologías con genes conocidos. La segunda mostró homologías con retrotransposones y secuencias virales. La tercera mostró homología con cDNAs correspondientes a la isovaleryl CoA deshidrogenasa de A. thaliana y a un sector de ARN ribosomal 23S del genoma cloroplástico. Este último clon aparece en forma repetitiva en el genoma nuclear y cloroplástico de Arroz.   Conclusiones A partir de los resultados obtenidos puede concluirse que una disminución en el número de complementos genómicos en E. curvula trae aparejadas modificaciones genómicas, algunas de las cuales parecen consistir en eliminaciones específicas de secuencias. Cuando se restaura el nivel de ploidía original, parece haber una recuperación de los mismos sectores. Por otra parte, en trigo (Shakedy col. 2001) y en pasto horqueta (P. notatum) (ver otro resumen presentado en esta misma reunión) se observó que un aumento del numero de complementos genómicos está asociado a eliminación de secuencias. Estas observaciones podrían sugerir que una alteración del nivel de ploidía de un genotipo, ya sea por aumento o disminución, provoca un shock genómico asociado a la eliminación de secuencias específicas. La pérdida o la ganancia de bandas durante la dihaploidización se recupera luego de una nueva tetraploidización, lo que parece sugerir cambios reversibles en el genoma, cuya estructura parece ser característica de un nivel de ploidía determinado. Durante el desarrollo de la inflorescencia se observaron diferencias en la expresión de algunos genes entre genotipos apomícticos (4x) y sexuales (2x). Estas diferencias pueden estar relacionadas con el mismo cambio de ploidía o con la alteración del modo de reproducción. Las secuencias obtenidas contribuyen a delinear las bases moleculares de la diplosporía en E. curvula, que son hasta el momento desconocidas.   Bibliografía Shaked H.. et al. (2001). The Plant Cell 13: 1749-1759. Voigt P .W. y Bashaw E.C. ( 1972).Crop Sci. 12: 843-847.